人胰高血糖素样肽-1串联体的克隆及其表达

为大量获取人胰高血糖素样肽-1,利用基因串联的方法构建了人胰高血糖素样肽-1的一组串联体.将化学合成的人胰高血糖素样肽-1（human glucagon like peptide-1, hGLP-1）cDNA基因插入质粒载体pET-32a(⁺)中,构建成硫氧还蛋白（thioredoxin）及六聚组氨酸（hexahistidine）与rhGLP-1的融合表达载体pET32-GLP-1.在此基础上将该融合基因序列进行同向串联,获得二串和三串的表达载体pET32-GLP-1-2 和pET32-GLP-1-3.将该三种表达载体转化大肠杆菌BLR(DE3)后获得相应的基因工程菌.结果表明：三种基因工程菌经发酵和IPTG诱导后均正确表达目的蛋白,目的蛋白表达量随着基因串数的增加而得到一定提高,重组蛋白经分离纯化后进行生物学活性测试具有明显的降低血糖浓度作用.     

采用胰高血糖素刺激C-肽释放实验判定糖尿病患者的β细胞功能

为评估糖尿病患者β细胞胰岛素分泌功能，采用胰高血糖素刺激C-肽释放试验评估糖尿病患者β细胞分泌功能，结果表明：在本组1型及2型糖尿病患者中，空腹及胰高血糖素刺激6min后血浆C-肽值差别明显；胰高血糖素刺激C-肽释放试验是一种简单可行、方便、重复性好的判断糖尿病患者β细胞分泌功能的方法。     

人胰高血糖素样肽-1突变体的生物学活性研究

为了解基因工程制备的重组人胰高血糖素样肽-1突变体（^2Gly-hGLP-1）的生物学活性，首先将重组hGLP-1和^2Gly-hGLP-1分别与二肽酰基肽酶Ⅳ（DPPⅣ）在37℃共同孵育．结果表明，与DPPⅣ孵育4h后，大于90％的hGLP-1被DPPⅣ降解，而85％以上的^2Gly-hGLP-1保持完整，可明显抵抗DPPⅣ的降解．之后将二者分别以12nmol／kg剂量腹腔注射Wistar大鼠，在不同时间点取血，测定血糖与血浆胰岛素水平．与对照组相比，腹腔注射重组hGLP-1和^2Gly-hGLP-1（12nmol／kg）可显著降低血浆葡萄糖水平，并提高血浆胰岛素水平（P〈0．001），且在15．30min时间点，^2Gly-hGLP-1的效应高于hGLP-1（P〈0．05）．     

胰岛素及胰高血糖素对大白鼠缰核离体脑片神经元单位放电的影响

实验观察了胰岛素、胰血糖素及乙酰胆碱对离体脑片侧缰核神经元单位放电的作用,结果显示胰高血糖素和乙酰胆碱对内侧缰核神经元自发放电起兴奋作用,胰岛素起抑制作用。推测胰岛素和胰高血糖素对缰核神经元活动的影响,可能与参与应激性防御反应过程有关。     

中草药中胰高血糖素受体拮抗剂的高通量细胞筛选

为筛选胰高血糖素受体拮抗剂，建立了一种高通量筛选胰高血糖素受体拮抗剂的细胞模型.利用PCR方法扩增得到人的胰高血糖素受体 cDNA，并连接到哺乳动物细胞表达载体pCDNA3.1上，构成质粒h glucagons-R/pCDNA3.1，将这种质粒与报告基因质粒(3×CRE/3×MRE/SRE-LUC)共转染到HEK293细胞，通过G418筛选，建立稳定的人胰高血糖素受体拮抗剂筛选细胞株.利用胰高血糖素受体内源激动剂探索和优化了筛选条件，筛选方法合理， Z′因子大于0.6，系统稳定，符合胰高血糖素受体拮抗剂的高通量筛选的要求.     

胰高血糖素样肽-1受体激动剂功能性报告基因分析系统的构建

用大鼠胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)基因转染带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的CH0细胞,成功地构建了基于G蛋白偶联受体信号传导途径的CHO/EGFP/GLP-1R检测细胞系.该细胞系能功能性表达GLP-1R并且能通过cAMP偶联的EGFP报告基因的表达评价GLP-1R激动剂的活性.利用该细胞系本文进一步对5种GLP-1与金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)不同形式连接的融合蛋白进行了体外活性评价.结果表明,5种融合蛋白的活性均低于天然的GLP-1,将GLP-1融合在SPA的N端与C端融合相比,能显著的提高其生物活性.在融合蛋白之问加入不同长度的重复序列(GGGGS),有助于提高其活性,但间隔序列的长短对活性没有显著的影响.以上结果表明,利用CHO/EGFP/GLP-1R细胞系,能够对GLP-1及其类似物的体外活性进行定性和定量的分析,为筛选和开发长效GLP-1类似物奠定了方法学基础.     

波纹唇鱼神经肽Y基因的克隆及原核表达

以波纹唇鱼为实验对象,采用同源基因克隆技术和RACE技术得到神经肽Y基因的cDNA全长序列.波纹唇鱼npy的cDNA全长序列为645 bp,包含59 bp的5'UTR、300 bp的ORF和286 bp的3'UTR.分子进化的比对分析表明,波纹唇鱼NPY前体与斜带石斑鱼和锯隆头鱼的亲缘关系最近.波纹唇鱼ORF编码99个氨基酸,NPY前体多肽包括:信号肽、成熟肽、Gly-Lys-Arg翻译后加工位点和羧基末端侧翼肽段(CPON).该NPY前体的预测分子质量为11.27 kD,理论等电点为5.51.采用pET-32a(+)原核表达系统构建波纹唇鱼npy基因的原核表达重组子pET-32a(+)-NPY,并获得重组菌株.对重组蛋白表达菌株进行培养条件优化,结果表明:该菌株在30℃,0.6 mmol/L IPTG,培养时间8 h的条件下,重组蛋白的表达效率最高.     

南方鲇(Silurus meridionalis)神经肽Y基因cDNA克隆及组织表达分析

以南方鲇(Silurus meridionalis)为对象,运用RT-PCR和RACE技术,获得神经肽Y(Neuropeptide Ty-rosing,NPY)基因cDNA的全序列.该基因cDNA全长743bp,包括3′非编码区(UTR)373bp,5′非编码区(UTR)82bp,开放阅读框(ORF)288bp,编码95个氨基酸.与其他脊椎动物进行同源性分析发现,南方鲇NPY序列与斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)的同源性最高,达79%,其次为瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachellii),同源性达76%.进化树分析也表明,南方鲇与斑点叉尾鮰和瓦氏黄颡鱼聚为一支.qPCR显示,南方鲇NPY mRNA在脑、心脏、肾脏、鳃、胃、肠和肝等7种组织中都有不同程度的表达,其中在脑中的表达量最高.     

1型糖尿病大鼠心肌缺血再灌注在体模型的时效研究

目的:探讨在1型糖尿病(T1DM)基础上如何有效建立大鼠在体心肌缺血再灌注(IR)模型.方法:SPF级SD雄性大鼠72只,随机分为6组(N1、N2、N3、T1、T2、T3组),N1、N2、N3组血糖正常,T1、T2、T3组实施尾静脉注射65 mg/kg剂量链脲佐菌素(STZ)T1DM造模,N1、T1组IR时间为30/90 min,N2、T2组IR时间为60/90 min,N3、T3组IR时间为60/180 min,每组12只.T1DM造模成功后,与正常血糖大鼠均饲养8 w,麻醉后开胸行心肌缺血再灌注,再灌注结束后经右颈静脉注入伊文思蓝染色,剪下大鼠心脏并洗净置于-80℃,冻结后应用心肌切片模具将心脏切成1 mm厚度薄片,置于含质量分数1%TTC与10%甲醛的磷酸盐缓冲液中染色固定,37℃下避光静置20 min,取出切片拭净残液,数码相机拍照,应用ImageJ图像处理软件计算心肌梗死面积.结果:N1、N2、N3、T1、T2、T3组心梗面积分别为(31.08±7.78)%、(39.31±11.89)%、(39.18±8.33)%、(32.16±9.57)%、(44.96±9.07)%、(45.99±12.10)%,N1组与N2、N3组之间差异均有统计学意义(P=0.042,P=0.046),T1组与T2、T3组之间差异均有统计学意义(P=0.008,P=0.010),N1组与T1组之间差异无统计学意义(P=0.785),N2组与T2组之间差异有统计学意义(P0.05),N3组与T3组之间差异有统计学意义(P0.05).结论:大鼠在体IR中缺血60min模型的心梗面积显著大于缺血30 min模型,在T1DM状态下,最佳心肌缺血时间在30~60 min之间.     

胰高血糖素样肽1受体N端片段与exendin-4的亲和位点分析

通过易错PCR(epPCR)方法建立了一个鼠肺的胰高血糖素样肽1受体(GLP-1R)N端片段的噬菌体随机突变展示肽库.根据筛选出的突变体来分析突变后胰高血糖素样肽1受体N端片段(nGLP-1R)与exendin-4结合活性.实验结果显示:保守的半胱氨酸C26发生突变后并未引起nGLP-1R与其配体exendin-4结合能力的改变,第101位和108位氨基酸是nGLP-1R与exendin-4结合的潜在位点.     

建立Ⅱ型糖尿病大鼠模型的探讨

目的探讨Ⅱ型糖尿病SD大鼠模型的稳定性与耐受性。方法采用连续4周喂养高脂饲料后,空腹一次性注射25 mg/kg链脲佐菌素的方法,建立Ⅱ型糖尿病SD大鼠模型。结果造模7 d后血糖值均高于6.78 mmol/L。持续观察22 d,血糖值后期略有波动,但稳定性与耐受性良好(均高于6.78 mmol/L)。结论采用高脂饮食,联合空腹一次性注射25 mg/kg链脲佐菌素的方法能成功建立Ⅱ型糖尿病SD大鼠模型。该方法建立模型简单、用药量小,有良好的稳定性与耐受性。     

姬松茸多糖对2型糖尿病大鼠SREBP-1c和SCD-1蛋白表达的影响

目的分析姬松茸多糖对2型糖尿病大鼠肝脏保护作用及对SREBP-1c和SCD-1表达的影响。方法将60只雄性SD大鼠(随机数字表)分为空白对照组、2型糖尿病模型组、姬松茸多糖组(150、100、50 mg/kg)及二甲双胍组(150 mg/kg),分别为A、B、C、D、E和F组。除A组外,B-F组均腹腔注射STZ(35 mg/kg)诱导复制糖尿病大鼠模型;A和组注射等体积生理盐水,C-F组按相应的药物及剂量进行灌胃处理干预,4周后取大鼠血清,检测血清FBG、TG、TC、HDL-C、LDL-C;取大鼠肝脏组织进行HE染色观察,采用qRT-PCR和Western blotting检测SREBP-1c和SCD-1 mRNA和蛋白水平。结果 B组大鼠血糖水平明显高于A组(P0.05),给药后C、D和F组血清FBG、LDL-C、TC、TG水平均显著低于B组(P0.05),而HDL-C水平高于B组(P0.05);与B组相比较,E组的FBG、LDL-C、TC、TG、HDL-C水平有降低的趋势,其差异无统计学意义。HE染色结果:与B组比较,C组和F组小叶结构清晰、肝细胞排列规则、肝脏细胞脂肪变性减少。qRT-PCR和Western blotting结果表明,B组肝脏SREBP-1c和SCD-1 mRNA和蛋白表达高于A组(P0.05);与B组相比较,C、D和F组肝脏SREBP-1c和SCD-1 mRNA和蛋白表达显著降低(P0.05),E组SREBP-1c和SCD-1 mRNA和蛋白降低,但差异无统计学意义。结论姬松茸多糖高、中剂量对2型糖尿病大鼠干预后,血糖血脂水平、肝脏SREBP-1c和SCD-1表达降低,肝脏细胞脂肪变性和肝细胞坏死减少,对肝脏有一定的保护作用,在治疗2型糖尿病中具有较高的应用前景。     

硫辛酸及胰岛素强化治疗对早发2型糖尿病胰岛功能的影响

目的探讨硫辛酸及胰岛素强化治疗对初发2型糖尿病胰岛功能的影响。方法采集60例初发的2型糖尿病患者,随机分成2组,对照组给予胰岛素强化治疗,实验组在胰岛素强化治疗的基础上,给予硫辛酸0.6 g溶于250 m L生理盐水中静脉滴注,根据血糖及时调整胰岛素剂量,4周为一疗程,治疗前后分别测定胰岛素分泌指数及胰岛素抵抗指数。结果与治疗前相比,2组胰岛素分泌指数明显增加,以实验组更为明显,2组胰岛素抵抗指数明显下降,同样实验组更为突出,且治疗组总有效率高于对照组(P=0.02)。结论硫辛酸联合胰岛素强化治疗初发2型糖尿病更能提高胰岛素敏感性,减轻胰岛素抵抗,更能促进胰腺B细胞功能的恢复。     

胰岛炎症导致的2型糖尿病发病过程的动力学模型及治疗策略

为了揭示胰岛炎症导致2型糖尿病发生发展的机制,建立胰岛 β 细胞和巨噬细胞相互作用的数学模型,包括IL-1β 的产生和巨噬细胞的浸润过程,研究高浓度葡萄糖和游离脂肪酸对IL-1β 的共同作用,揭示胰岛炎症在2型糖尿病进程中的动力学机理.通过对模型中动力学参数的敏感性分析,提出针对不同患病情况的可能的优化治疗策略.     

口服降糖药继发失效的2型糖尿病患者β细胞功能及其影响因素

为研究口服降糖药继发失效的2型糖尿病患者内源性胰岛β细胞功能及病程、肥胖、血脂等因素对其的影响.以98例住院的2型糖尿病患者为研究对象,静脉注射1mg胰高血糖素,刺激前和刺激后6min的ΔCP值表示内源性胰岛β细胞分泌功能.根据体重指数(bodymassindex,BMI)、病程和口服降糖药(oralhypoglycemicagents,OHA)有效和继发失效(secondaryfailure,SF)分组,比较各组ΔCP值,分析BMI、病程等对ΔCP值的影响.结果发现:①空腹C肽(F CP)随BMI增加而增加,BMI<23、23≤BMI<25、BMI≥25组间比较有显著性差异(P<0.01),但ΔCP三组间无明显差异.②ΔCP随病程的延长呈进行性下降(P<0.05),病程小于5年、5～10年和大于10年各组中发生口服降糖药继发失效的分别为58%、76%、89%.③非肥胖(BMI<23和23≤BMI<25)组:SF发生率分别为79%、68%,SF组ΔCP均比OHA组显著降低(P<0.001).肥胖(BMI≥25)组:SF发生率为69%,SF组ΔCP比OHA组低,无显著性差异.SF组病程比OHA组病程长(P<0.05).④ΔCP与BMI、TG呈正相关(r=0.33,P=0.001;r=0.33,P=0.001),与病程呈负相关(r=-0.31,P=0.002).多元逐步回归分析示病程对ΔCP影响较大.表明肥胖的2型糖尿病在疾病的早几年比非肥胖的2型糖尿病存在明显高胰岛素血症.内源性胰岛β细胞分泌功能主要与病程有     

成人1型糖尿病患者尿白蛋白比肌酐比值的相关因素分析

目的糖尿病肾病(DKD)与1型糖尿病(T1DM)患者终末期肾功能衰竭、心血管疾病风险增加密切相关.本研究拟探讨成人T1DM患者尿白蛋白比肌酐比值(UACR)的相关因素,构建UACR升高预判模型.方法纳入2016年1月至2017年12月广东省1型糖尿病转化医学研究数据库中符合标准的成年T1DM患者,收集患者基本特征和临床指标.根据UACR水平将患者分为UACR正常组(UACR<30 mg/g)和UACR升高组(UACR≥30 mg/g),比较组间人群基本特征,筛选UACR升高相关因素.并利用多因素Logistic回归模型分析UACR的主要相关因素,构建Nomogram模型预判UACR升高概率.结果共纳入495例患者,平均年龄(34.44±11.65)岁,平均病程(7.83±6.22)年,女性296例(59.8%).分组后UACR正常组纳入385例(77.8%),UACR升高组110例(22.2%).组间比较发现UACR相关因素包括病程、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、静息心率、糖化血红蛋白(HbA1c)、估算的葡萄糖处置率对数值(lneGDR)、是否合并高血压.多因素Logis...     

维生素A 对2 型糖尿病大鼠模型胰岛纤维增生的影响

摘要: 目的观察维生素A 对2 型糖尿病( T2DM) 大鼠胰岛纤维增生的影响。方法维生素A 补充2 周后,将GK大鼠胰腺石蜡切片行HE 和Masson 染色,观察胰岛纤维化区域变化。结果补充维生素A 组GK ( Goto-Kakizaki)大鼠胰岛纤维增生区域明显减少。结论外源性给予维生素A 能显著减少T2DM 胰岛纤维增生。     

2型糖尿病患者胰岛素样生长因子1水平及相关影响因素

为了探讨2型糖尿病(T2D)患者外周血血清胰岛素样生长因子1(IGF-1)水平与糖脂代谢水平的关系,分析T2D患者血清IGF-1的相关影响因素。通过选取2010年5月～2012年1月就诊于内蒙古医科大学附属医院、内蒙古中医院内分泌科的179例T2D住院患者作为病例组(T2D组),另选取30例内蒙古医科大学体检中心正常健康体检者作为对照组(CK组)。采集研究对象空腹外周血,应用ELISA法检测血清IGF-1水平;检测T2D患者生化血脂指标和糖代谢指标水平,利用调查问卷收集研究对象的一般资料、行为习惯和体格检查,计算体质指数(BMI)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)及胰岛素敏感性指数(HOMA-IS)。将T2D组患者IGF-1水平按照第25、75百分位数分为低IGF-1水平组(B组)、中IGF-1水平组(C组)和高IGF-1水平组(D组),CK组为对照组(A组)进行比较的方法,研究IGF-1水平与以上指标的相关性。结果表明:T2D组与CK组IGF-1水平差异显著(P 0. 01)。A组、B组、C组和D组比较中,年龄、性别、吸烟史、饮酒史、运动情况及BMI差异显著(P 0. 05);空腹血糖(FPG)、餐后2 h血糖(2PPBS)和糖化血红蛋白(Hb Alc)差异有统计学意义;三组载脂蛋白A(Apoal)均与对照组差异显著,D组的高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)与A组相比差异有统计学意义。相关性分析显示,血清IGF-1水平与运动情况(Spearman铁相关系数为0. 23,P=0. 001)存在关联。以IGF-1浓度为因变量的多因素Logistic回归分析中,血清IGF-1水平与胰岛素敏感性、年龄、BMI和Apoal、FPG、空腹胰岛素(FINS)及Hb Alc的交互作用正相关,与HDL-C负相关。可见胰岛素敏感性、年龄、BMI及Apoal、FPG、FINS与Hb Alc的交互作用可能为IGF-1水平的独立危险因素,HDL-C可能为独立保护因素。     

甘精胰岛素联合诺和龙对2型糖尿病患者 胰岛功能及TNF-α,IL-6的影响

目的研究甘精胰岛素联合诺和龙对于高血糖状态的初发2型糖尿病患者胰岛功能、TNF-α及IL-6的作用.方法选取初发2型糖尿病高血糖状态患者120例,随机平均分为观察组和对照组,每组60例.两组患者均给予糖尿病饮食控制、运动训练和健康知识讲座等基本治疗.对照组在此基础上予以诺和灵30R治疗;观察组在此基础上予以甘精胰岛素联合诺和龙治疗.治疗3个月后复查患者TNF-α、IL-6、胰岛素水平和低血糖事件发生率.结果观察组患者空腹胰岛素水平显著低于对照组(P0.05),而餐后2 h胰岛素水平显著高于对照组(P0.05),差异具有统计学意义.观察组患者TNF-α,IL-6水平均显著低于对照组(P0.05),差异具有统计学意义.低血糖事件发生率观察组显著低于对照组(P0.05),差异具有统计学意义.结论甘精胰岛素联合诺和龙控制血糖效果好,能有效改善2型糖尿病高血糖状态患者体内胰岛功能,同时降低TNF-α,IL-6水平.     

Exendin-4治疗糖尿病的研究进展

糖尿病还伴随着诸多并发症,现已成为仅次于恶性肿瘤和心血管疾病之后的第三大健康杀手。本文介绍了一种治疗糖尿病的新药物Exendin-4,对其在结构上的特点以及药理活性进行了综述。