生物转化法重组谷氨酸脱羧酶合成γ-氨基丁酸

成功构建了一个高效表达大肠杆菌谷氨酸脱羧酶GAD来源的重组质粒pET28a-gadA,并转化E.coli BL21(DE3),工程菌株经0.4mmol/L IPTG或1g/L的乳糖, 37℃诱导表达8h,粗酶液的酶活达到12U/mL,大约是出发菌株E.coli K-12的60倍.工程菌1.15U粗酶液以31g/L L-谷氨酸钠为底物, 37℃、pH 4.0条件下反应4h,γ-氨基丁酸的生成量达到19.57g/L, L-谷氨酸钠的转化率为93%,从而为γ-氨基丁酸的生产提供了很好的前景.     

固定化N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶拆分消旋蛋氨酸

基因工程菌BL21/pET22b-argE可高效表达N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶。将含酶细胞包埋于海藻酸钙凝胶中制成固定化细胞酶,用于消旋蛋氨酸的拆分,并将其拆分能力、拆分速度及操作稳定性与游离细胞酶相比较。结果表明：单批次转化固定化细胞酶的拆分能力和游离细胞酶相近,拆分速度较慢;但多批次转化的操作稳定性显著高于游离细胞酶。重复利用8次后的固定化细胞酶仍保有95%以上的酶活力,重复利用5次后的游离细胞酶活已降至20%左右。每克湿菌泥在游离和固定化条件下重复拆分产L-蛋氨酸的量分别为74.16mmol和241.93mmol。酶拆分液中的L-蛋氨酸经重结晶后光学纯度为98.3%。固定化细胞酶比游离细胞酶更具有工业化应用的潜质。     

结核分枝杆菌H37Rv组氨醇脱氢酶基因的克隆、表达及酶学性质分析

以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,扩增hisD基因,构建pET-28a-HDH重组质粒;转化重组质粒到E.coli BL21(DE3)并诱导表达,纯化可溶性的结核分枝杆菌L-组氨醇脱氢酶(HDH),并对其性质进行研究,结果表明:重组结核分枝杆菌L-组氨醇脱氢酶能以L-组氨醇和NAD 为底物催化L-组氨醇生成L-组氨酸;该酶的最适pH值为8.3,最适温度为45℃,比活力为1.788 U/mg;Mn2 ,Ca2 ,Zn2 ,Co2 等对酶促反应有激活作用;底物NAD 和L-组氨醇的米氏常数分别为0.9765 mmol/L和2.755μmol/L;25℃时重组蛋白的二级结构中有20.5%的α-螺旋,40.9%β-折叠,4.2%β-转角,34.3%无规卷曲.     

λ噬菌体切除酶基因Xis在大肠杆菌中的可溶性融合表达

λ噬菌体切除酶Xis(excisionase)是调控λ噬菌体溶源裂解转换过程中的一种重要蛋白质.通过密码子优化及两步法将来自λ噬菌体切除酶基因Xis在体外合成,然后克隆到带有类泛素蛋白SUMO标签的定向原核表达载体SUMO-p ETG上,测序正确后,然后转化至E.coli BL21(DE3)细胞可溶性表达.经SDS-PAGE及质谱检测证实表达蛋白确实为目的蛋白.该研究通过融合表达λ噬菌体切除酶Xis不仅解除了Xis对E.coli宿主细胞的毒害作用,而且实现在E.coli中的高水平可溶性表达.因此,Xis的大量制备,将会促进Gateway克隆技术的广泛应用.     

结核分枝杆菌H37Rv高丝氨酸激酶基因的克隆、表达及酶学性质分析

采用PCR方法克隆到结核分枝杆菌H37Rv的高丝氨酸激酶基因thrB,将其连接到pET-28a( )表达载体中,在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中经丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导得到高效表达.用Ni·NTA His·Bind亲和层析柱对表达的活性重组蛋白进行了分离纯化,并对其酶学性质进行了研究.结果表明:重组结核分枝杆菌高丝氨酸激酶能以L-高丝氨酸和ATP为底物催化L-高丝氨酸生成O-磷酰-L-高丝氨酸,该酶的比活力为2.946 U/mg,对底物L-高丝氨酸和ATP的米氏常数分别为2.303 1 mmol/L和2.342 9 mmol/L.     

微生物膜法制备聚天冬氨酸

本文提出以富马酸为原料,通过高效微生物催化剂,在膜生物反应器中合成L-天冬氨酸,然后采用盘式连续缩聚反应器,调控引发剂引发反应,合成不同粘均分子量的聚天冬氨酸产品,最终实现聚天冬氨酸的工业化、连续化、经济化生产。     

天冬氨酸转氨酶及其酶学性质

从大肠杆菌中提取了天冬氨酸转氨酶,并对其酶学性质进行了系统的研究,得出该酶的最适反应温度为37 ℃、最佳反应pH范围为8.0～8.5、最佳氨基供体为L-天冬氨酸、转化反应动力学常数Km,同时对影响该酶作用的其它因素(辅酶、金属离子)作了研究.利用几种α-酮酸,考察了该酶在转化制备相应的芳香族L-氨基酸过程中的作用.为该酶的工业化应用提供了理论上的依据.     

糖多孢红霉菌酮还原酶域在羰基还原中的应用

为研究糖多孢红霉菌聚酮合成酶模块1的酮还原酶域,催化羰基还原的底物特异性和立体选择性,PCR扩增了该酶域的编码基因(eryKR1),并将其克隆到表达载体pET-28a,得到重组质粒pET-eryKR1,转化到Escherichia coli BL21(DE3)后,获得了重组菌株E.coli BL21(pET-eryKR1).将E.coli BL21(pET-eryKR1)和异源表达枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因的重组大肠杆菌E.coli BL21(pET-gdh1)进行双重组菌耦合,对4-氯乙酰乙酸乙酯、苯乙酮、2-辛酮和环己酮4种底物进行转化还原,利用气相色谱分析转化液,结果显示E.coli BL21(pET-eryKR1)对环己酮的还原效果较好,产物环己醇的得率最高可达93.24%,而对其他3种底物几乎没有还原能力.利用E.coli BL21(pET-eryKR1)2催化2-甲基环己酮不对称还原,产物主要为顺式-2-甲基环己醇,产率可达41.87%,产物的对映体过量值为74.81%.     

大肠杆菌二硫键异构酶DsbC的表达、纯化及活性分析

将大肠杆菌二硫键异构酶DsbC基因克隆到表达载体pRSETc中,并在宿主菌E.coli BL21(DE3)中通过IPTG诱导进行可溶性表达.用Ni-NTA亲和层析柱从菌体裂解液中纯化了His6-DsbC,通过Superdex 75凝胶过滤层析获得纯His6-DsbC蛋白.Western blot和凝胶过滤层析分析表明,该蛋白以二聚体的形式存在.通过RP-HPLC分析,表达的His6-DsbC以氧化型和还原型存在,并且该两种形态在一定的氧化还原体系中能够相互转化.HRP重折叠实验说明,重组DsbC能够提高HRP的复性率.     

L-酪氨酸的合成研究

本文研究了L-酪氨酸的合成,采用有机合成法和酶转化法相结合的方法,主要原料为对羟基苯甲醛和海因,合成对羟基亚苄基苯丙酮酸粗品,再经过碱解得到对羟基苯丙酮酸,选取合适的酶对碱解液催化转氨,生成L-酪氨酸。含量达到99%以上。     

全细胞生物转化法制备γ-氨基丁酸

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyrate,GABA)是广泛存在于自然界的一种非蛋白质的功能性氨基酸.它是哺乳动物中枢神经中一种重要的抑制性神经递质.为了高效廉价制备GABA,采取谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD)催化L-谷氨酸生成GABA的工艺.从K12来源的大肠杆菌(E. coli)基因组中PCR扩增得到GAD基因片段,并克隆到载体p ET-23a中,得到重组质粒p ET-23a-K12gad,并将其转化至大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中,获得了能够重组表达GAD活性的工程菌株.从反应温度、p H、菌体量这三个方面对催化工艺进行了优化.为了进一步降低成本,通过化学法将谷氨酸钠转化为谷氨酸作为催化底物,提高转化速率的同时简化了纯化工艺.     

细胞转化法生产L—苹果酸的研究

报道普通变形杆菌细胞转化法生产Ｌ－苹果酸的研究,探讨菌体培养和转化反应条件等因素对菌体延胡索酸活性的影响、菌体酶的热性和ＰＨ稳定性。确定最佳工艺条件和酶的稳定性条件分别为：菌体培养时间７２ｈ,转化反应温３５℃,底物转化液ＰＨ７．０,转化反应时间３ｈ;温度≤３５℃,ｐＨ６．０－７．８,菌体经过１０批次转化反应后,其延胡索酸酶活性仍很稳定,酶活保存率达８７．０％。     

大肠杆菌麦芽糖转糖基酶 MalQ基因克隆与融合表达

用PCR方法获得E.coli K12 MalQ基因,将该基因插入原核表达载体pET-DsbA中,对质粒所含外源片段双向测序,并经BLAST比较分析,发现其与GenBank中报道的E.coli K12 MalQ基因的同源性高达99％。重组质粒转化E.coli BL21(DE3) plysS,经IPTG诱导后以融合蛋白形式表达,SDS-PAGE电泳显示MalQ基因与DsbA表达的融合蛋白在目标位置约103kDa处有明显条带。经薄层层析分析粗酶液酶处理的麦芽三糖溶液,证实粗酶液具有麦芽糖转糖基活性     

淀粉接枝共聚物共固定糖化酶和葡萄糖异构酶研究

以多孔球状淀粉接枝共聚物为载体,以对一卜硫酸酯乙砜基苯胺（SESA）为载体活化剂,采用重氮化法共价偶联共固定糖化酶和葡萄糖异构酶．该共固定双酶体系适用于各种类型的淀粉底物,在PH6．0,60℃条件下,共固定双酶体系能将5％（质量浓度）DE－27糊精一步转化为果糖含量为20％的果葡糖浆,其催化效率是天然酶体系的1．6倍．     

高产S-腺苷蛋氨酸合成酶基因工程菌的构建

应用PCR技术,以大肠杆菌BL21（DE3）染色体DNA为模板,扩增得到S-腺苷蛋氨酸（SAM）合成酶基因。将所得基因连接至表达载体pET-22b（+）,利用T7强启动子进行转录,然后转化进E. coli BL21（DE3）表达菌株,构建出了具有高效表达SAM合成酶基因的基因工程菌。重组菌所表达的酶活为115U/g（以细胞干重计）。     

米根霉L-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

文章以米根霉基因组DNA为模板,根据已公布的米根酶L-乳酸脱氢酶基因(ldnL)序列设计引物,PCR扩增得到含有ldnL的DNA片段;PCR产物T/A克隆后再双酶切,将ldnL片段连接到大肠杆菌表达载体pET17b,得到重组表达质粒pET17b-ldnL;pET17b-ldnL转化大肠杆菌BL21(DE3),摇瓶培养诱导表达后的菌体经SDS-PAGE电泳分析,结果表明克隆的ldnL基因在大肠杆菌中实现表达。     

生物酶法合成L-茶氨酸和聚谷氨酸的高效同步分离纯化

利用γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyl transpeptidase,γ-GGT,EC 2.3.2.2)催化,以谷氨酰胺和乙胺为底物进行酶反应.反应后主要成分为L-茶氨酸和聚谷氨酸(poly γ-glutamic acid,PGA),杂质有氯离子、乙胺以及少量谷氨酰胺和谷氨酸.通过弱酸性阳离子树脂和弱碱性阴离子树脂...     

褐藻胶裂解酶基因的克隆、表达载体构建以及表达条件的研究

以产褐藻胶裂解酶的紫色链霉菌(Streptomyces violaceoruber)为出发菌株,应用基因工程技术,将褐藻胶裂解酶aly基因进行克隆,并构建了该基因的重组表达载体pET23b(+)-aly.通过表达条件的初步优化,实现了aly基因在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中的成功表达.在IPTG诱导浓度为0.1mmol/L,诱导时间为8h,诱导温度为16℃的条件下,细胞破壁后上清中ALY粗酶液活力为6U/mg.根据褐藻胶裂解酶ALY的蛋白质结构预测结果推断该酶属于Algi-nate lyase-2家族,理论pI为8.85,理论分子量大小为28 500,化学式为C1252N1920H356O394S9.SDS-PAGE蛋白电泳检测发现,ALY蛋白的分子量约为28 000,与预测的蛋白分子量较为接近.     

溶剂法合成聚琥珀酰亚胺

以L-天冬氨酸为原料,采用溶剂法合成聚琥珀酰亚胺,并研究了催化剂、反应时间和混和溶剂配比对反应的影响．用凝胶渗透色谱测定了聚琥珀酰亚胺的相对分子质量,并用FTIR和^1H NMR对其进行了结构表征．     

重组E.coli L-天冬酰胺酶的克隆及表达与纯化

以大肠杆菌菌株(E.coli AS 1.357)基因组为模板,PCR扩增L-天门冬酰胺酶Ⅱ基因(ans B),构建p MD18-Tans B重组克隆载体和p ET-22b-ans B重组表达载体,转化大肠杆菌BL21宿主菌株,重组工程菌经IPTG诱导表达Ans B蛋白,利用重组His-tag,通过Ni-NTA亲和层析纯化Ans B蛋白,利用SDS-PAGE定性分析Ans B蛋白,考马斯亮蓝法测定Ans B蛋白含量,获得纯化的质量浓度为62.7 mg/L的Ans B表达蛋白。重组L-天门冬酰胺酶的纯化收率为42.28%,酶活达137 IU/m L,较原始菌株的(6.87 IU/m L)提高近20倍,并排除大肠杆菌自身L-天门冬酰胺酶本底表达背景。