一株茶树内生放线菌的分离鉴定及抗菌活性测定

从茶树内生真菌芒果球座菌(Guignardia mangiferae)的菌落表面分离获得1株放线菌菌株BF-01,通过形态学观察和16S rDNA序列分析及抗菌活性测定,初步鉴定该菌株为卡伍尔链霉菌(Streptomycescavourensis).对其代谢产物进行了抑菌活性的初步研究,发现该菌发酵产物对除1株木霉外的7株茶树内生真菌及6株植物病原真菌均表现出不同程度的抑制作用.其发酵液氯仿萃取物对供试的5种病原细菌、1种白假丝酵母菌有较明显的抑制作用,对2种植物病原真菌的孢子萌发也有较强的抑制作用,表明菌株BF-01及其代谢产物具有广谱的抑菌活性.     

小链霉菌HCCB10043敲除硫酯酶基因的工程菌株构建及其代谢产物的研究

小链霉菌(Streptomyces parvus)HCCB10043的主要代谢产物为脂肽类化合物A21978C,其基因组序列中包括了非核糖体肽合成酶(NRPS non ribosomal peptide synthetase)、聚酮合酶(PKS polyketide synthases)以及NRPS-PKS混合的多酶体系基因簇,它们的共同特点是在代谢产物生物合成簇中连接有一个硫酯酶域,即TE(thioesterase)domain.硫酯酶可以使已经合成的化合物链的合成过程终止,并且具有水解释放成熟脂肽以及环化线性脂肽链的功能.通过对联二吡啶类代谢产物合成簇中TE基因的敲除构得工程菌株,工程菌发酵结果表明联二吡啶类代谢产物产量减少.     

Streptomyces albovinaceus DSM 40136中环二肽的盐胁迫发掘

该文选择陆生放线菌Streptomyces albovinaceus DSM 40136,结合菌株肽类次级代谢产物生物合成基因簇的分析,利用盐胁迫策略对其进行产物发掘,成功地利用添加海盐质量分数为3%的M-ISP4培养基激活菌株生产出具有多种生物学活性的环二肽Cyclo(L-Pro-L-Leu).该产物的发掘表明:利用海盐胁迫策略可有效应用于陆生放线菌次级代谢潜能的激活,且新产物的发掘也为环二肽生物合成研究及代谢工程改造提供了良好的出发菌株.     

添加前体对2株真菌次级代谢产物及其生物活性的影响

为探究添加前体物质对红树植物杨叶肖槿(Thespesia populnea)来源内生真菌Talaromyces sp.YX-001和Penicillium sp.YX-002次级代谢产物及其生物活性的影响,选取马铃薯葡萄糖液体(Potato Dextrose Broth, PDB)培养基和察氏(Czapek′s)培养基,分别在其中添加2种前体物质(甲戊二羟酸和酪氨酸),采用12孔板对菌株进行微量发酵培养。通过分析菌株次级代谢产物的产量、HPLC指纹图谱、乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制活性、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除活性和卤虫致死活性,探究添加前体物质前后菌株次级代谢产物的化学多样性和生物活性的变化情况。结果表明：添加2种前体物质均可使菌株次级代谢产物的产量和化学多样性增加,但生物活性的变化有所不同。酸性环境可能会促进菌株中具有较好DPPH自由基清除活性的次级代谢产物的合成,但其具体机制还有待进一步研究。本研究为深入研究杨叶肖槿内生真菌Talaromyces sp.YX-001和Penicillium sp.YX-002的次级代谢产物奠定了基础。     

抗农作物病原真菌微生物的筛选及其聚酮合酶基因的分析

以5种农作物病原真菌为指示菌,从湖北省神农架地区的土壤中筛选得到1株抗真菌放线菌,命名为ⅡR21菌株.经过形态观察、培养特征、生理生化分析和16S rDNA序列同源性分析,初步鉴定该菌株属于链霉菌属.发酵液稳定性研究表明：ⅡR21菌株发酵液在－20℃～80℃范围内具有较强的稳定性;在pH 4.0～7.0范围内,ⅡR21菌株发酵液的抑菌活性比较稳定;紫外光照射对发酵液的抑菌活性没有影响.对放线菌ⅡR21菌株中Ⅰ型PKS基因族中KS基因进行PCR扩增和分析,与其他KS序列相似性比较低,与其系统分类最近的Streptomyces natalensis相似性达77%.     

拮抗黄瓜枯萎病原真菌放线菌的筛选

从南京师范大学仙林校区不同植被根际采集土壤样品,采用稀释平板法分离得到25株放线菌,以黄瓜枯萎病原真菌为指示菌,筛选出5株具有抑菌活性的菌株。将其中拮抗活性较强的2株菌进行发酵培养,同时采用滤纸片法复筛,得到拮抗活性较强的放线菌A5,初步鉴定为链霉菌属(Streptomyces.sp)。     

鹭宁两地植物根际土壤中放线菌的生物多样性分析及生物活性检测

为探究不同地区植物根际土壤中可培养放线菌的多样性,筛选具有抗菌及抗肿瘤活性的药源菌株,采用改良聚乳酸-明胶和海藻糖-脯氨酸2种培养基,选择分离采自厦门市翔安区香山风景区、南京市中山植物园及玄武湖公园的17份植物根际土壤样品中的放线菌,并进行16SrRNA基因鉴定、系统进化分析及抗菌和抗肿瘤生物活性测定.共分离到178株放线菌,其中链霉菌151株,其余27株为稀有放线菌,占总数的15.2%.稀有放线菌分布在9个属中:微杆菌属(Microbacterium)、拟无枝酸菌属(Amycolatopsis)、韩国生工菌属(Kribbella)、野野村氏菌属(Nonomuraea)、小单孢菌属(Micromonospora)、链孢囊菌属(Streptosporangium)、拟孢囊菌属(Kibdelosporangium)、纤维微菌属(Cellulosimicrobium)和栖白蚁菌属(Isoptericola),包含2株新种.对分离得到的所有放线菌进行液体小量发酵,并测定其发酵粗提物的抗菌和抗肿瘤活性.结果显示:所测定的178株放线菌中,有82株对一种或多种指示菌表现出抗菌活性,占供测菌株的46.1%;有60株对一种或多种肿瘤细胞具有抑制作用,占供测菌株的33.7%.研究结果表明植物根际土壤中放线菌资源丰富,其中抗菌和抗肿瘤活性较强的菌株可为后续微生物药物研发提供有利资源.     

Screening of the antifungal strains of actinomycetes and the study on one of the active strains

以白色念珠菌为指示菌,采用平板琼脂块法进行初筛和发酵液纸片法进行复筛,得到抗真菌活性较强的放线菌8株,对其中一株活性放线菌菌株205-10经16S rDNA方法初步鉴定为阿南德氏链霉菌(Streptomyces anandii),并用不同的温度、pH及紫外线处理发酵液以了解其活性代谢产物的稳定性,用不同有机溶剂进行萃取实验了解其极性.结果表明其活性代谢产物在70℃以下抗真菌活性保持不变,在pH 6～8活性不变,但在紫外灯照射下活性稳定性较不理想,活性物质存在于正丁醇和水中,可知其极性较大.     

连翘中具有药物活性成分内生菌的筛选及其拮抗特性的研究

采用组织分离法从连翘枝条中筛选出13株内生菌,其中有7株内生真菌,6株内生细菌。分别以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌为指示菌株,采用平板对峙法对分离出的13株内生菌的抗菌活性进行筛选。结果表明：13株菌种中有10个菌株对1种供试菌具有抑菌活性。其中L-07-01、L-07-09、L-07-12、L-07-13的拮抗效果明显,L-07-09对金黄色葡萄球菌具有较强的抑菌效果,测量其抑菌圈直径为10 mm。L-07-12对大肠杆菌具有较强抑菌效果,测量其抑菌圈直径为10 mm。对拮抗效果较强的菌株进行液体发酵培养后采用双层打孔法,测定其抑菌效果后证明L-07-13对金黄色葡萄球菌有极强的抑制效果。对拮抗后的指示菌进一步镜检后,发现菌体有明显的溶菌、空洞、畸形等现象。连翘内生菌可以产生丰富的具有药物活性的次生代谢产物,可作为新型药物的筛选源。     

药用植物虎杖内生放线菌的分离及抑菌活性的研究

采用平板涂布法从药用植物虎杖(Polygonurn cuspidatum)中分离出内生放线菌41株,以大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌(Salmonella typhl)、白色念珠菌(Monilia albican)为靶标菌,采用滤纸片扩散法研究了虎杖内生放线菌发酵液的抑菌活性。结果显示,共有13株内生放线菌对5种靶标菌表现了不同程度的抑菌活性,占分离总数的31.7%。有5株内生放线菌表现出较明显的抑菌活性,特别是PEA004和PEA013菌株对枯草芽孢杆菌的抑菌圈分别达17 mm,15 mm,并且对其它几种靶标菌也表现出不同程度的抑菌活性。     

利用KS基因筛选Ⅱ型聚酮类化合物产生菌的方法研究

根据酮基合酶编码基因(ketoacyl synthase,KS)的同源性设计简并引物,并利用PCR技术快速筛选携带聚酮类化合物编码基因的放线菌菌株.试验筛选了33株放线菌菌株,检测获得PKSⅡ型阳性菌株16株.克隆并测序获得16条KS基因序列,进行BLAST同源性比对,与GenBank中已知的KS基因序列的相似度在89%~99%之间.提交GenBank,获得的各菌株KS基因登录号为FJ620885~FJ620889,FJ620892,FJ878801~FJ878810.抑菌实验表明,携带KS基因的16株放线菌中,13株具有抑制真菌活性,2株具有抑制革兰氏阳性细菌活性.系统进化树分析表明16株放线菌可以分为7个类群,其中,具有产生新型聚酮类化合物潜力的菌株8株,说明筛选出的KS基因具有一定的多样性.结果表明,利用PCR技术可以快速有效筛选Ⅱ型KS基因,为生物资源的开发利用奠定基础.     

内生放线菌A00122中germicidin生物合成基因的克隆

在植物和细菌中,Ⅲ型聚酮合酶能够产生种类多样的次生代谢产物.在药用植物内生放线菌A00122的发酵产物中,分离到了一个已知的Ⅲ型聚酮类化合物germicidin.对A00122菌株建立了基因组文库,根据已知的同源基因Sco7221设计引物作为探针对文库进行PCR筛选,并通过Southern杂交的方法从阳性克隆5-3-10中定位了包含germi-cidin基因的片段,经测序得到长度为1 185 bp的完整合成基因.该基因的获得为深入研究Ⅲ型聚酮合酶的底物选择性,通过定向改造的方法获得非天然Ⅲ型聚酮类化合物提供了重要基础.     

药用植物内生真菌分离及其次级代谢产物生物活性研究

为分离药用植物中内生真菌,从次级代谢产物中筛选对单胺氧化酶和乙酰胆碱酯酶有较高抑制率的提取物.用分块法分离5种植物,马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基纯化内生真菌,液体培养基发酵,用乙酸乙酯萃取菌液,甲醇提取菌丝体,用酶标法检测提取物对单胺氧化酶和乙酰胆碱酯酶的抑制率.共分离得到45株菌,制备了90种提取物,其中5株菌的菌液提取物对单胺氧化酶有不同程度的抑制率,露蕊乌头39(LRWT-39)的菌液提取物对单胺氧化酶的抑制率最高,所有提取物对乙酰胆碱酯酶的抑制率不高.表明药用植物内生真菌中存在抗单胺氧化酶的活性成分,值得进一步研究.     

陕西略阳铁矿尾矿放线菌的分离、鉴定及抗菌活性

针对陕西略阳铁矿尾矿土壤放线菌进行分离鉴定,研究放线菌代谢产物抗菌活性。采用稀释涂布法对陕西略阳铁矿尾矿土壤样品进行分离纯化,通过菌落形态观察初步排重,对所有菌株进行16S r RNA测序,通过构建发育树确定其菌属。同时采用滤纸片扩散法,以大肠杆菌(Escherichia coil)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、沙门氏菌(Salmonella typhl)和白假丝酵母菌(Canidia Albicans)为靶标菌研究放线菌代谢产物拟菌活性。分离出菌株结合形态学及分子生物学鉴定确认14株菌株,其中10株属链霉菌属(Streptomyces)、3株属于小单孢子菌属(Micromonospora)、1株属原小单孢菌属(Promicromonospora)。鉴定所得14株放线菌代谢产物均表现出不同程度的抑菌活性,其中10株则表现出较明显的抑菌作用,占总数的71.43%。表明尾矿土壤所分得菌株丰富,可判断所分离放线菌中链霉菌属占较大比例,且筛选出有较强抑菌活性的菌株,为丰富和挖掘放线菌资源库提供理论依据。     

蒲公英内生真菌的抗菌活性物质筛选

蒲公英中获得强抗菌活性的内生真菌,分析其次级代谢产物的化学结构,为新颖抗菌 活性天然产物的发现奠定基础。通过滤纸片法筛选获得抗菌活性目标菌株,采用形态学和分子生 物学方法鉴定真菌的种属,并采用质谱-分子网络技术预测真菌的次级代谢产物的化学结构。从 21株形态各异的蒲公英内生真菌中筛选获得了1株抗菌活性较好的菌株2-7,粗提物对4种金黄色 葡萄球菌在10 μg/片浓度下抑菌圈为10.82~17.58 mm,其种属鉴定为Alternaria sp.,该真菌可代谢 产生黄酮、甾体、生物碱、脂肪酸、丁内酯、萜类等化合物,其中黄酮分子簇中的部分母离子可能为 潜在的新化合物。     

5种药用植物内生真菌的分离及其抑菌活性的研究

从樟树、女贞、十大功劳、绞股蓝及荔枝草的叶片、叶柄、茎和枝条等部位分离内生真菌,并以金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌为试验菌对分离的内生真菌进行了抑菌活性筛选.结果从5种药用植物中共分离出124株内生真菌,其中37株内生真菌对一种或多种供试菌有抑制作用,高抗菌活性菌株有11株.     

麻黄内生真菌的分离及其生物活性初步研究

从内蒙古赤峰等地的中草药麻黄中分离得到141株内生真菌,体外抗氧化、抗肿瘤等活性测定表明,有11株内生真菌对H2O2具有较好的清除活性(LD50均大于50,LD50为抑制率为50%时的样品稀释倍数),占菌株总数的7.80%;有27株内生真菌对Raji和HepG-2具有肿瘤细胞毒活性(LD50大于50),占菌株总数的19.15%,其中以抑制悬浮Rajii细胞为主.此外,在141株菌中,有74株对一种或二种以上的指示菌显示出抑菌活性,占菌株总数的52.48%.本实验结果表明,麻黄中含有丰富的内生真菌,是抗氧化、抗菌及抗肿瘤等活性物质的重要来源.为进一步从中草药植物中分离筛选新药先导化合物提供了科学依据.     

Caspase-3抑制剂的筛选体系构建及药物筛选

Caspase-3是细胞凋亡途径中重要的靶蛋白,研究Caspase-3抑制剂或激活剂,对治疗心脑血管疾病、肿瘤等具有积极意义.利用原核表达系统高效表达Caspase-3,并以表达的粗酶构建基于Caspase-3抑制剂的体外高通量筛选模型,随后对实验室保存的960种放线菌次级代谢产物进行筛选,获得9株具备分泌Caspase-3抑制剂活性的菌株,随后进一步复筛,确认了2株具备分泌高活性的Caspase-3抑制剂的菌株pwh890和pwh891,均可抑制80%的Caspase-3活性.最后对pwh890分泌的次级代谢产物进行初步分离纯化,获得31.3mg纯度较高的抑制剂,为后续的抑制剂的结构解析和改造奠定基础.     

放线菌BJLSH9菌株兼抗线虫及烟草疫霉菌的生防活性及其杀线虫代谢产物鉴定

 从采自北京柳树的根际土中分离到对线虫和病害真菌具有较好生防活性的放线菌菌株BJLSH9.该菌株对烟草疫霉菌丝生长抑菌率达50.05%,48 h的杀线虫活性高达98.05%.在40 L发酵罐用38号培养基培养BJLSH9菌株,根据其生物活性及菌体生物量确定适宜的发酵时间为72 h.经16S rRNA基因分析,将BJLSH9菌株鉴定为黄抗霉素链霉菌(Streptomyces flavofungini).从BJLSH9菌株的次生代谢产物中鉴定出一种杀线虫化合物tryptophandehydrobutyrine diketopiperazine (TDD),该化合物对线虫48 h的致死率为40%.黄抗霉素链霉菌及其产生的TDD化合物的杀线虫活性为首次报道.     

乌头内生真菌YLAC-3抗菌活性及其鉴定

为了筛选产乌头碱的内生真菌,采用组织分离法从白喉乌头根中分离内生真菌,用纸片扩散法检测内生真菌对4种指示菌的抑菌作用,通过薄层层析法（TLC）和高效液相色谱法（HPLC）检测真菌次生代谢产物中乌头碱,最后基于真菌形态特征和rRNA基因内转录间隔区（ITS）序列分析对菌株进行鉴定.结果显示：从白喉乌头根部共分离得到20株具有抑菌活性的内生真菌,其中菌株YLAC-3发酵液对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念球菌均有较强的抑菌活性,且其发酵液中发现类似于乌头碱的化合物.说明菌株YLAC-3发酵液有较为广泛的抑菌活性,它可能产生乌头碱.菌株YLAC-3菌落、菌丝体和分生孢子的形态特征类似于曲霉菌属,与已报道的塔宾曲霉菌ITS序列（KP196359）的相似度为99%.初步鉴定该菌株为曲霉菌属有效发表种Aspergillus tubingensis的一个菌株.