产纤维素酶海洋细菌的筛选和酶学性质的初步研究

从病烂的海洋植物中分离到一株高产纤维素酶的菌株TX-12,革兰氏阴性,经鉴定为噬纤维菌属(Cellulophaga sp.)中的一个种.该菌株在温度25℃、培养基起始pH 8.0条件下培养56 h产生碱性纤维素酶活力高达354.8 U/mL.酶学性质初步研究显示,TX-12产生的纤维素酶最适反应pH值为8.0,最适反应温度为60℃,在0～100℃酶活均能保持最高酶活的70%以上.酶液在100℃时仍具有较高的稳定性.Fe2+、Cu2+、Mn2+对酶反应有一定促进作用,Hg2+和Pb2+对酶反应有强烈的抑制作用.     

γ-亚麻酸菌株少根根霉原生质体形成与再生

用 6mg/m L纤维素酶 + 3mg/m L蜗牛酶 + 1 mg/m L溶菌酶作为混合酶酶解 2 8℃培养 2 6h的菌丝。以含 0 .6mol/L NH4Cl磷酸缓冲液 ( p H6.0 ) ,+ 0 .0 2 mol/L Mg SO4· 7H2 O+ 0 .4mmol/L Ca Cl2 作为渗透压稳定剂 ,酶解前以 0 .3% β-巯基乙醇处理 35 min,从少根根霉的菌丝中获得了大量的原生质体。同时对菌丝的培养时间、渗透压稳定剂、酶解系统和酶解温度等因素进行了观察 ,获得了制备原生质体的最适条件。并对该原生质体在高渗培养基上进行了再生实验     

产琼脂糖酶海洋微生物的筛选鉴定及酶学性质研究

从红藻中筛选获得一株能产生明显液化现象并具有较高琼脂糖酶活力的菌株Ag-1,经生理生化实验和16S r DNA序列分析鉴定为弧菌属(Vibrio sp.).酶学性质研究表明,该酶的最适反应温度为50℃,40~50℃水浴保温1 h可保持68%以上的酶活力;最适反应p H值为8.0,在p H 7.0~8.0保温1 h可保持90%以上的酶活力,在p H 8.0~9.0保温1 h仍可保持70%以上的酶活力,具有较好的耐热性和耐碱性;且该酶对琼脂底物具有高度专一性;K+、Ca2+、Mg2+、Li+和Fe3+对琼脂糖酶活力具有激活作用,Mn2+、Zn2+和Cu2+对琼脂糖酶具有抑制作用.酶反应动力学实验结果表明,该酶的最适底物浓度为8 mg·m L-1,动力学参数Km为0.58 mg·m L-1,vmax为3.29 U·mg-1.     

参环毛蚓肠道内源性纤维素酶的分离纯化及酶学性质分析

通过对参环毛蚓肠道组织提取液进行DEAE阴离子交换及凝胶过滤层析,获得参环毛蚓单一的内源纤维素酶的活性组分.根据AlpHaEaseFCTM软件计算出该组分分子质量约为45 ku,命名为Cx1.羧甲基纤维素钠(so-dium carboxymethylcellulose,CMC)法对Cx1进行酶学性质分析.分析结果显示:对于底物羧甲基纤维素钠,Cx1的米氏常数(Km)为0.289 mg/mL,Vmax为0.446 U.mL-1.min-1,反应最适温度为55℃,最适pH为6.0,在40~60℃、pH5.0~8.0具有较好的热稳定性和pH稳定性,其相对酶活力都能保持在55%以上.Ag+和Ba2+对Cx1起显著激活作用,K+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、NH4+、Ni2+、Na+、Pb2+部分抑制酶活性,Cu2+离子对Cx1有完全抑制作用,而Fe2+对酶活力无明显影响.     

碱性脂肪酶产生菌--扩展青霉K40原生质体的制备和再生

采用 0 .6%纤维素酶加 0 .6%蜗牛酶的混合酶由扩展青霉 K4 0中获得大量的原生质体 ,并比较了菌龄、二硫苏糖醇 ( DTT)预处理方式、酶解时间、温度、 p H、培养基成分及稳定剂等因素对原生质体的形成和再生的作用 .选出制备原生质体的最适条件 :0 .6%纤维素酶 +0 .6%蜗牛酶 ,在 0 .6mol/L Na Cl+0 .3 %Ca Cl2 ,DTT预处理 0 .5h,菌龄为 1 9～ 2 0 h,p H 5.4 ,2 8℃酶解 3～ 3 .5h,原生质体产量可达 2 .3 6× 1 0 7个/ml,实现再生 ,再生率达 70 %～ 80 % .并对原生质体的释放和再生方式进行跟踪观察     

结合区部分缺失的纤维素酶基因的克隆与表达及酶学性质初步测定

从梧桐腐枝上分离到一株可降解纤维素的细菌菌株,发现克隆于该菌株的内切纤维素酶基因(egt)结合区部分缺失(8 bp),导致移码并提前终止,全长1 146 bp,编码381个氨基酸,分子量为40. 06 k D.克隆含有完整结合区的基因(eg),通过酶学性质研究,表明两者均仅具有羧甲基纤维素钠活性,纤维素酶EGT和EG的最适反应温度分别为45℃和55℃,EGT更加耐高温.最适pH均为7. 0,都具有较好的pH稳定性.Mn~(2+)、Fe~(2+)对两者具有激活作用,Zn~(2+)、Ca~(2+)、K~+、NH_4~(2+)和Mn~(2+)对其都具有抑制作用.EGT的K_m=3. 09 mg/mL,比酶活为98. 4 U/mg; EG的K_m=8. 654 mg/mL,比酶活为53. 53 U/mg. EGT结合区的部分缺失导致酶与底物的亲和能力更好,同时比酶活提高183%,水解能力更强.     

支链淀粉酶产生菌的筛选及发酵条件的研究

从淀粉加工厂附近的土壤中分离出一株产耐热、嗜碱性支链淀粉酶的菌株 ,初步鉴定为嗜碱芽孢杆菌 SX- 12 .优化后的最佳发酵培养基为 :可溶性淀粉 3.0 g,蛋白胨 1.0 g,酵母膏 0 .5 g,K2 HPO4 0 .2 g,Mg SO4 · 7H2 O 0 .0 5 g,最适 p H 8.5 ,最适温度 4 0℃ .酶活从最初的 2 .4 u/ m L提高到 4 .6 2 u/ m L .酶的最适 p H 9.0 ,最适温度 5 5℃ .Ca2 + ,Mn2 + ,Mg2 + 等离子是酶的激活剂 ,Zn2 + ,Hg2 + 等离子是抑制剂 .     

米曲霉(Aspergillus oryzae)沪酿3.042内切型纤维素酶的分离纯化与鉴定

为了解米曲霉纤维素酶在物料分解过程中的作用,从米曲霉沪酿3.042成曲中提取粗酶液,利用DNS法分析了粗酶液中外切酶、内切酶及β-葡萄糖苷酶的活力.用刚果红染色法确定了沪酿3.042成曲粗酶液中含有4种内切型纤维素酶,分别称为Cx酶Ⅰ,Cx酶Ⅱ,Cx酶Ⅲ和Cx酶Ⅳ.经DEAE-Cellulose-52离子交换层析,0.15,0.20,0.25,0.30mol/L NaCl洗脱峰均测得内切型纤维素酶活性,制备电泳纯化得到4个内切型纤维素酶组分,SDS-PAGE结果显示,Cx酶Ⅰ,Cx酶Ⅱ,Cx酶Ⅲ为单体酶,分子质量分别为31 800,34 000,26 000u,Cx酶Ⅳ含有4个亚基,分子质量分别为14 000,23 600,26 000,33 500u.粗酶液中内切型纤维素酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH值为4.0.     

海洋贝类肠道弧菌21Z1碱性蛋白酶的分离纯化及酶学性质

由威海海域贝类肠道中分离出一株产胞外碱性蛋白酶的细菌,经16S rDNA分析鉴定为弧菌21Z1。该菌发酵液上清经60%饱和度的硫酸铵溶液沉淀、透析、Sephadex-G100分子筛层析等步骤,获得电泳纯的21Z1碱性蛋白酶,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示其分子量约为31 kDa。酶学性质测定结果显示:该酶最适反应温度为40℃,在20~40℃稳定;最适反应pH为8.5,在pH=8.5~11.0间稳定;Na~+、K~+、Ca~(2+)、Mn~(2+)对该酶具有激活作用,Fe~(2+)、Fe~(2+)、Zn~(2+)及Cu~(2+)则不同程度地抑制其活性;该酶的耐盐性检测结果显示,在Na~+浓度为4 mol/L时,残余酶活在62%以上,表明21Z1碱性蛋白酶具有较强的耐盐性。     

耐热α-淀粉酶的筛选、基因克隆和酶学性质分析

【目的】筛选耐热α-淀粉酶并实现异源表达,同时分析其酶学性质特征。【方法】以M9培养基加上可溶性淀粉作为选择性分离培养基,从腾冲火山温泉土壤中筛选到产淀粉酶的菌株Anoxybacillus sp.GXS-3。根据淀粉酶氨基酸保守序列,设计引物进行PCR扩增,然后对目标序列进行步移扩增,获得淀粉酶基因AmyGX。将AmyGX与表达载体pQE30连接,导入大肠杆菌M15中表达,对重组酶进行分离纯化和酶学性质分析。【结果】AmyGX基因长1 515 bp,编码505个氨基酸残基,前23个氨基酸残基为信号肽序列;重组质粒pQE30-AmyGX编码的蛋白分子量为58.04kDa,对可溶性淀粉催化水解反应的最适温度为60℃,最适pH值为8.0,V_(max)、K_m值分别为0.19U/mg、3.14mg/mL,热半失活温度T_(50)~(30)值为65.2℃;Zn~(2+)、Cu~(2+)、Co~(2+)、Fe~(3+)、Ba~(2+)对该酶具有明显的抑制作用,Na~+、K~+对该酶有激活作用,Mg~(2+)、Ca~(2+)的影响则不明显。【结论】AmyGX是一种中等耐温碱性酶,在造纸、洗涤剂生产和有毒废弃物去除等方面具有潜在的应用前景。     

产纤维素酶芽孢杆菌DS1309的分离鉴定及产酶条件研究

通过唯一碳源法从来源于长白山森林的土壤中筛选到多株具有纤维素降解活力的细菌,选取其中的1株芽孢杆菌DS1309进行了鉴定及发酵条件的初步优化,结果显示该菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。发酵产酶的最适条件为培养温度30℃,培养基初始p H6.0,最适碳源为葡萄糖,最适碳源为酵母粉。菌株在最适条件下培养48h达到产酶高峰,酶活力可达到1.82 IU/m L。     

青藏高原土壤产淀粉酶菌株的分离、鉴定及产酶特性研究

从青藏高原农田采集的13份土样中筛选到10株产淀粉酶活力较高菌株,其中菌株ZF-3产酶活性最高,该菌株采自定日县海拔4400 m左右处.通过菌落形态、生理生化特性和16S r RNA序列比对,鉴定该菌株为萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus).对其粗酶液酶学性质研究表明,酶反应最适温度为60℃,最适作用p H值6.0,Ca2+、Ba2+、Zn2+、Mn2+、Fe2+等多种金属离子对酶活有明显的激活作用,Mg2+对酶活有抑制作用.     

产结晶纤维素酶的嗜热菌鉴定及其酶学性质

从云南腾冲热海温泉采集的样品中,分离出一株产结晶纤维素酶的嗜热菌TC-1.该菌株呈杆状,革兰氏阴性,生理生化特征分析和16S rDNA序列同源性比对表明它属于亚栖热菌属Meiothermus.结晶纤维素、木聚糖和葡萄糖可以诱导该菌产生结晶纤维素酶,其中结晶纤维素诱导的酶活力最高.对其产生的结晶纤维素酶进行了初步纯化与酶学性质研究,该酶的最适反应温度为70℃,最适pH为6.0,在50℃～70℃和pH5.5～6.5之间酶活力相对稳定.     

内切葡聚糖酶的纯化及其基本性质

纤维素酶是自然界碳素循环中的一种关键酶,它可以将纤维素性材料,转化为可直接利用的葡萄糖,并可通过其它酶和酶系统的作用转化为乙醇及蛋白质。纤维素酶是多酶体系,包含外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶(Cx)及β-葡萄糖苷酶。其中内切葡聚糖酶含有若干种同工酶,能将可溶性纤维素转化为还原寡糖,是纤维素酶系中的重要组分,为了深入研究Cx酶的性质,本文对其中一种Cx酶进行了分离纯化,并对其基本性质进行了研究。 1实验部分     

高产芽孢杆菌MS12木聚糖酶发酵条件优化及酶学性质研究

从昆明某磷矿土壤中筛选出一株产木聚糖酶能力较强的菌株——MS12,通过单因素试验初步优化了该菌株的产酶条件.试验结果显示,该菌株最佳产酶培养基为玉米芯粉50 g/L、麸皮40 g/L、NH_4Cl 10 g/L、CaCl_2 5 g/L、NaHPO_42 g/L,pH自然;最佳产酶发酵条件为30℃,180 r/min,装样量30 mL/250 mL三角瓶,震荡培养96 h.经测定,菌株MS12所产木聚糖酶的最适反应温度为65℃,最适反应pH值为7.0,具有较好的pH稳定性. 1 mmol/L Na~+、Ba~(2+)和10 mmol/L Ca~(2+)、Mg~(2+)对酶活有促进作用,Ag~+对酶活有明显的抑制作用.     

短乳杆菌来源重组β-半乳糖苷酶初步分离纯化与酶学特性研究

将实验室克隆得到的E. coli BL21/pET28a-bga B-18重组菌株在IPTG的诱导下进行表达,对其表达的β-半乳糖苷酶性质进行研究.首先,通过离心收取重组菌菌体;其次,通过超声破碎菌体细胞,再用镍柱对重组蛋白质进行亲和层析;最后,收集层析液,再利用紫外分光光度计测定重组β-半乳糖苷酶活性,并研究其酶学性质.结果表明:该酶的最适反应温度为37℃,最适pH值为7.5;在温度30～50℃、pH 6.0～8.0范围内酶稳定性较好; Mg~(2+)、Mn~(2+)为其激活剂,Cu~(2+)为其抑制剂;测得K_m=0.816 mmol/L,V_(max)=45.87 mmol/(L·min).     

降纤酶的分离纯化及其性质

蛇毒蛋白对抑制血栓形成和溶解血栓具有较好的疗效 ,但由于得不到性质稳定、组分单一的酶蛋白 ,影响了其临床效果。该研究通过亲和层析方法 ,从长白山白眉蝮蛇乌苏里种蛇毒中分离提纯到 SDS- PAGE图谱为单一组分糖蛋白——降纤酶 ,相对分子质量约 3.6× 10 4。该酶具有体外凝血、体内抗凝作用。等电点约为 4 .2 5。HPL C分析结果表明其纯度为 99%。最适温度为 70℃ ,最适 p H =8.0。动力学研究表明该酶为一 Michaelis- Menten酶 ,Michaelis常数为0 .32 0 mm ol/ L,最大反应速度为 0 .117μm ol/ m in。EDTA,Mg2 + ,Cu2 + 对其有抑制作用。测定该酶 N端 2 0个氨基酸的序列是 Val Ile Glu Glu Asp Glu Cys Asn Ile Asn Glu His Arg Phe L eu,与其他的蛇毒类凝血酶有高度同源性。     

产纤维素酶的解淀粉芽孢杆菌分离鉴定及酶学性质研究

对一株产纤维素酶菌株进行分离鉴定,并对其酶学特性进行了初步研究.刚果红染色法筛选产纤维素酶菌株B16,采用形态观察、生理生化指标和16S rDNA确定其菌属来源,分析纤维素酶的最适反应pH值和温度、酸碱和热稳定性、金属离子对酶活性的影响,最后考察纤维素酶系的分布.结果表明:筛选菌株为解淀粉芽孢杆菌,其较适反应温度为30℃,较适pH 8.0,在10~60℃呈高稳定性,在pH 5~8时稳定性较强,Mn2+和Ba2+是该酶的激活因子.除微晶纤维素酶活力(16.39 U/mL)稍弱外,滤纸酶(70.37 U/mL)、β-葡萄糖苷酶(131.55 U/mL)、羧甲基纤维素酶(307.23 U/mL)活力均相对较高.结果表明,该酶在饲料添加剂方面具有应用潜力.     

产碱性纤维素酶真菌产酶条件的研究

研究了碱性纤维素酶生产菌株镰刀霉菌(Fusarum Sp.)的产酶条件.结果表明:该菌株产碱性纤维素酶的适宜碳源为1%麦杆粉+1%可溶性淀粉,最适氮源为O.2%的(NH_4)_2SO_4加0.1%的酵母粉,接种量为5%,培养时间为72 h,培养温度为46℃,培养基初始pH为8.0.在最适宜的条件下,培养液中内切葡聚糖酶活力可达到1.29 IU/mL,而天然纤维素酶活力和滤纸酶活力却很低.具有这种组分结构的碱性纤维素酶系统在棉织品的生物整理及洗涤剂工业中具有良好的应用前景.     

芦荟叶皮β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质

库拉索芦荟叶皮经匀浆、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液抽提,硫酸铵分级沉淀,DEAE-Sepharose fast flow层析和Superdex-200prep grade层析,获得电泳纯的β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase,BGL).纯化结果是β-葡萄糖苷酶比活力为98.48U/mg,纯化倍数为328.27倍,酶活性回收率为9.87%,全酶分子质量约为69.3kD,亚基分子质量约为69.7kD.酶学性质研究表明:β-葡萄糖苷酶的最适反应温度和最适反应pH值分别为40℃和5.0;在20~30℃及pH4.0~8.0范围内稳定性较好;最适条件下,以pNPG为底物的K_m值为2.21mmol/L,V_(max)为1.381μmol/(min·L).乙醇,抗坏血酸,Mn~(2+),K~+对该酶活性具有激活作用;SDS,Cu~(2+)对该酶活性具有强烈抑制作用;异丙醇,EDTA,尿素,Mg~(2+),Li+对该酶活性影响较小;甲醇对该酶有双重作用.