海洋灰绿曲霉聚酮合酶基因的克隆与序列分析

为了研究海洋灰绿曲霉中抗肿瘤聚酮化合物灰绿霉素A的生物合成机制,需获得相关的聚酮合酶基因簇。根据灰绿霉素A合成途径推断,该化合物母核由非还原型PKS(NR-PKS)催化合成,本文使用LC系列简并引物得到灰绿曲霉中NR-PKS基因片段,再通过基因走读技术得到22.8kb的DNA序列,其含有7个完整的开放阅读框。通过BLAST分析,序列中包含1个NRPKS编码基因,全长8 451bp,命名为Agpks1。AgPks1与烟曲霉PksP、黑曲霉Alb1有很高的同源性。该工作对研究Agpks1对灰绿霉素A或其他聚酮产物合成的催化机制具有重要意义。     

朝鲜崖柏挥发性化合物及其相关基因表达

朝鲜崖柏(Thuja koraiensis)体内含有挥发性化合物，具有药用价值，研究挥发性化合物的相关基因对了解其合成十分重要.使用气相色谱-质谱(GC-MS)技术分析朝鲜崖柏体内挥发性化合物，根据转录组数据的代谢途径确定与挥发性物质相关的基因；用定量PCR(qRT-PCR)研究挥发性物质相关基因的表达模式.共鉴定出84种挥发性化合物.结果表明：Kaur-16-烯，(8β,13β)-(53.472%)、双环[9.3.1]十五碳-3,7-二烯-12-醇、4,8,12,15,15-五甲基-[1R-(1R*,3E,7E,11R*,12R*)]-(5.698%)、十六烷(5.197%)和1,1′-联苯，2,2′,5,5′-四甲基-(4.918%)是朝鲜崖柏的主要化合物，并发现10种化合物具有同分异构体；代谢途径分析表明，与Kaur-16-烯和角鲨烯合成相关的14个基因被注释到两个代谢途径上，这14个基因涉及ent-copalyl二磷酸酯合成酶、ent-kaurene合成酶和角鲨烯合成酶；与5月的基因表达量相比，所有的基因在6月、7月和8月均上调表达，而在1月、2月、3月、4月、10月、11月和...     

丙酰辅酶A的体外酶法合成

丙酰辅酶A(丙酰-CoA)是一种重要的代谢中间物,可以用来生产丙烯酸、3-羟基丙酸、β-羟基戊酸和聚酮化合物。将天然的琥珀酰辅酶A合成酶、甲基丙二酰辅酶A变位酶、甲基丙二酰辅酶A脱羧酶在大肠杆菌中克隆并过表达,采用这3种纯化的酶体外催化合成丙酰-CoA,评价了琥珀酸生产丙酰-CoA代谢途径。琥珀酸可经琥珀酰辅酶A合成酶催化生成琥珀酰-CoA,琥珀酰-CoA再由甲基丙二酰辅酶A变位酶催化生成甲基丙二酰-CoA,最后甲基丙二酰-CoA经甲基丙二酰辅酶A脱羧酶催化生成丙酰-CoA。反应产物经高效液相色谱分析,检测到目标产物丙酰-CoA,结果证明了从琥珀酸体外合成丙酰-CoA的代谢途径的可行性。     

对氨基苯甲酸生物合成基因pabAB的缺失对抗生素FR-008生物合成的影响

抗生素FR-008是由链霉菌FR-008产生的一种七烯大环内酯类抗真菌抗生素,它以对氨基苯甲酸(PABA)为起始单位,在I型聚酮合酶(PKS)的催化下合成聚酮内酯环.前期生物合成基因簇序列测定发现了可能的对氨基苯甲酸生物合成基因(pabAB),编码4-氨基-4-脱氧-分支酸(ADC)合成酶.通过同框缺失实验获得pabAB发生缺失的基因置换突变株BLQ-1并通过聚合酶链式反应(PCR)扩增进行了验证.高效液相色谱(HPLC)分析和生物测定证实突变菌株BLQ-1丧失了合成抗生素FR-008的能力.这种产量的丧失可以通过回补克隆的pabAB基因或喂养外源PABA得到回复.实验证明,pabAB负责对氨基苯甲酸的合成,是抗生素FR-008生物合成的必需基因.     

荧光假单胞菌phlD基因的克隆、表达及功能

对荧光假单胞菌合成2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-DAPG)操纵子的关键基因phlD进行了克隆,并采用E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)对phlD进行了诱导表达,其指导合成的PhlD蛋白融合表达后为42000Da.生物信息学方法分析PhlD具有PKSⅢ型聚酮合酶的结构及催化聚酮缩合、酰基转移反应的功能,并推测PhlD催化底物丙二酸单酰辅酶A经过聚酮缩合途径合成间苯三酚及其衍生物.对重组菌进行了摇瓶发酵并检测出发酵液中确有产物间苯三酚的合成.     

内生放线菌A00122中germicidin生物合成基因的克隆

在植物和细菌中,Ⅲ型聚酮合酶能够产生种类多样的次生代谢产物.在药用植物内生放线菌A00122的发酵产物中,分离到了一个已知的Ⅲ型聚酮类化合物germicidin.对A00122菌株建立了基因组文库,根据已知的同源基因Sco7221设计引物作为探针对文库进行PCR筛选,并通过Southern杂交的方法从阳性克隆5-3-10中定位了包含germi-cidin基因的片段,经测序得到长度为1 185 bp的完整合成基因.该基因的获得为深入研究Ⅲ型聚酮合酶的底物选择性,通过定向改造的方法获得非天然Ⅲ型聚酮类化合物提供了重要基础.     

粗糙脉孢菌BenR基因在哈茨木霉中的定点转化

以β2-微管蛋白基因为定点整合位点,通过原生质体法将多菌灵抗性基因转化到哈茨木霉中,获得了具有多菌灵抗性的生物防治工程菌株．多菌灵抑制抗性转化子菌丝生长的ECso值达471．26μg／mL,比哈茨木霉原菌株提高1200倍以上;转化子对多菌灵的抗性具有遗传稳定性,且在无选择压力下菌丝生长速度及菌落形态与原菌株无显著差别;抑菌活性检测结果表明,3个转化子对立枯丝核菌均具有较强的抑菌活性,对菌丝生长的抑制率分别为87．5％、86．3％和85％．     

链霉菌辅酶Q9生物合成基因sdsA的鉴定

聚异戊二烯焦磷酸合成酶基因在4个不同种的链霉菌(Streptomyces coelicolor A3(2), Streptomyces maritimus, Streptomyces mycarofaciens ATCC 21454和Streptomyces sp.Tü4128)中分别被克隆.测序结果显示:4个聚异戊二烯焦磷酸合成酶基因均编码336个氨基酸的肽链,4条肽链之间的序列有97%的同源性.将4个不同的聚异戊二烯焦磷酸合成酶基因分别导入大肠杆菌中进行异源表达,有辅酶Q9产生.将4个基因分别导入八聚异戊二烯焦磷酸合成酶(IspB)缺陷的大肠杆菌KO229(ΔispB)中证明它们有替代ispB基因的功能,并且在大肠杆菌中合成辅酶Q9.     

松科植物萜类合成酶及其基因家族研究进展

萜类化合物是松科(Pinaceae)植物中重要的代谢物,它们与松科植物生长发育、信息传递、气候适应和化学防御等关系密切,在植物生理和生态等方面具有重要功能。松科植物萜类化合物还广泛应用在制药、生物燃料以及合成化学等工业领域,具有重要的经济价值。松科植物通过甲羟戊酸途径和甲基赤藓糖磷酸途径合成所有萜类物质合成所必需的5碳前体,并在异戊烯基转移酶家族、萜类合成酶家族作用下合成单萜、倍半萜和二萜等不同长度碳链的萜类分子骨架,并进一步在细胞色素P450酶家族的作用下发生甲基化、羟基化、过氧化、糖基化等酶促反应形成具有结构极为丰富的萜类化合物。和其他次生代谢过程类似,多种酶及其基因在萜烯化合物形成过程中起到了至关重要的作用,同时,萜类化合物结构多样性的形成也主要依赖于萜类合成酶及其基因。植物中已经发现了大量的萜类合成酶,由于大量植物基因组、转录组等组学数据的公布,不断有新的萜类合成酶被报道。笔者介绍了植物萜类化合物前体的合成途径及其关键酶基因、植物萜类合成酶的结构和类型,着重阐述松科植物萜类合成酶结构、功能以及相应基因家族鉴定和系统分类的研究进展,并针对松科植物萜类合成酶及其基因研究领域存在的研究树种偏少、松科植物萜烯类代谢可能存在的特异代谢路径重视程度不够、适用于针叶树种相关基因的功能研究平台搭建欠缺、多基因网络调控松科植物萜烯类合成机制研究未得到系统开展、产脂和抗逆相关的松科植物关键基因未得到挖掘与利用等相关问题提出了建议,以期为松科植物萜类生物合成机制解析及松科植物遗传改良提供参考。     

高产IAA绿色木霉工程菌株的构建及其应用

农药和化肥的滥用,对人类健康及生存环境构成极大威胁,研制出能够降低化肥用量的的新型肥料十分必要,符合农业可持续发展的新型肥料十分必要。木霉作为新型肥料的常用功能微生物,在农业领域有着广泛的用途。在众多的促生防病机制中,通过产生吲哚乙酸(indole-3-acetic acid,IAA)来促进植株生长是木霉发挥作用的重要方式。为了进一步增强木霉的促生抗病能力,我们在绿色木霉Tv-1511中鉴定并克隆了IAA生物合成途径关键酶色氨酸合成酶(tryptophan synthase,TRPS)的编码基因TvTRPS以及色氨酸脱羧酶(L-Tryptophan decarboxylase,TDC)的编码基因TvTDC,构建了TvTRPS基因和TvTDC基因过表达的绿色木霉工程菌,并研究了其对木霉耐胁迫能力,产IAA能力,植物促生能力等的影响。结果表明,过表达TvTRPS基因和TvTDC基因的木霉工程菌合成IAA的能力显著提高,并且具有更强的耐胁迫能力和促生能力,为绿色木霉在农业生产上的进一步应用奠定了基础。     

何首乌中一种Ⅲ型PKS基因的克隆及生物信息学分析

Ⅲ型聚酮合酶即查耳酮合酶超家族,能催化生成一系列结构各异、具有不同生理活性、含有查耳酮合酶基本骨架的植物次生代谢产物。根据不同植物Ⅲ型PKSs基因的保守序列,设计简并引物,采用RT - PCR和RACE技术,首次从传统中药材何首乌(Polygonum multiflorum Thunb.)中克隆到一种Ⅲ型PKS基因,其cDNA全长1228bp, 编码379个氨基酸,命名为FmPKS (GenBank登录号: GQ411431)。该基因含有三个内含子, 与迄今报道的绝大部分Ⅲ型PKS含有一个内含子不同,而与最近报道的虎杖中克隆的PcPKS2基因相同。通过生物信息学方法对其编码蛋白的序列进行同源性分析,构建了系统进化树,并对其等电点、疏水性及二级结构、跨膜区域等理化性质进行了初步预测,为进一步研究其功能奠定了基础。     

利用RNA干扰沉默马尔尼菲青霉菌聚酮合酶基因的相关研究

在实验室前期建立的马尔尼菲青霉菌cDNA文库中筛到了1个马尔尼菲青霉菌聚酮合酶基因cps(Cit-rinin Polyketide Synthase),为了研究这个cps基因的功能,构建了RNAi表达盒,表达盒内具有目的基因编码序列422 bp的反向重复序列并被gus基因隔开.整个干扰载体借助根癌农杆菌体系成功转化马尔尼菲青霉菌,并受木糖的诱导启动子xy/p调控RNA干扰.研究发现cps基因沉默的转化子产生与母代红色菌株不同的白色菌株,类似基因敲除的表型,表明cps基因与该青霉菌色素的形成直接相关.     

木霉T11-W及苹果枝条木屑对黄瓜幼苗生长的影响

为探寻苹果树修剪枝条资源化快速利用的方法，以黄瓜（津研四号）为试材，分别测定了苹果枝条培养木霉T11-W后(处理木屑)和同时添加木霉对盆栽黄瓜幼苗生长发育的影响，并与不同添加量的未处理苹果枝条（原木屑）处理和单独木霉T11-W处理进行对比。结果显示：单独木霉T11-W处理对黄瓜幼苗生长促进效应最为显著；原木屑质量分数为0.7%时，添加木霉可改善其对根长的抑制，并能进一步提高根的干物质量；木霉+木屑处理(处理木屑或原木屑)综合评价虽不如单独木霉T11-W处理，但根冠比最高；原木屑处理用量0.35%时，对黄瓜幼苗生长的综合促进作用弱于空白对照，用量0.7%时，促进作用高于空白对照，表明原木屑添加量大，利于黄瓜幼苗生长；木屑在0.35%使用量时，处理木屑对黄瓜幼苗的促生长作用优于原木屑处理。     

Cloning, prokaryotic expression,purification and sequence analysis of 20S proteasome subunit gene from T.harzianum

The gene encoding the 20S proteasome subunit（PR29） was cloned from cDNA library of Trichoderma harzianum and expressed in Escherichia coli BL21 （D3） using a pET-28a expression system. The molecular weight of the protein was found to be approximately 29 kDa, as estimated by SDS-PAGE on gels. The target protein was insoluble when induced at 22℃ with 0.4 mmol/L IPTG, while dissoluble if induced at 37℃ with 0.8mmoL/L IPTG. The expressed product was purified through Ni-magnetic beads His Bind. The purity of the fusion protein reached above 80%. The entire eDNA sequence consisted of 1094 bp with 173 and 135 bp in 5＇ and 3＇ untranslated regions respectively. The gene encoding 261 amino acids has no signal peptide sequence. These results could provide a basis for validating the func-tions of PR29. It also provided a preliminary indication for further study of the mechanism and function of proteasome, and more information of proteasome mechanism in T.harzianum could be obtained.     

南澳大利亚麦田茄丝核菌抑病土中木霉菌的特性和鉴定

从抑制Rhizoctonia solani的麦田土中分离到木霉菌,依据形态特征,鉴定为Trichoderma pseudokoningii,T.parceramosum,T longibrachianum和T.harzianum。取样土壤为灰质砂壤土,pH8．4(H2O),位于南澳大利亚的埃文。研究了与生物防治作用机制相关的生理学特性包括几丁质酶活性、β-1,3-葡聚糖酶活性、内切葡聚糖酶活性、抗菌活性以及重复寄生能力。T。pseudokoningii生长速度快但是产分生孢子少,但是T.parceramosum产分生孢子多。与其他种类相比,Trichoderma pseudokoningii的分离频率高,在盆载条件下对小麦Rhizoctonia solani根腐病以及全蚀病防治效果高,对R．solani的重复寄生能力强。Trichoderma pseudokoningii菌株问的重复寄生能力差异不明显,但在几丁质酶活性和β-1,3-葡聚糖酶活性上有明显差别。依据平板抑菌能力,可将木霉菌株分为3个组。菌株在不同pH培养基上的生长速度不同,但没有发现特别能适应碱性条件而快速生长的菌株,虽然这些菌株都分离自碱性土壤。     

哈茨木霉复合种内3个中国新记录种的分离和鉴定

采用THSM选择性培养基,从西藏、山东和云南等地的土壤中分离获得木霉菌株Z19、CX58-4 和CY358-5。通过形态学特征、ITS rDNA和TEF-1α序列对菌株进行鉴定。结果表明,3个菌株属于哈茨木霉(Trichoderma harzianum)复合种,分别是非洲哈茨木霉(T. afroharzianum)、深褐木霉(T. atrobrunneum)和西蒙斯木霉(T. simmonsii),均为木霉属中国新记录种。     

哈茨木霉T23和3种土壤有益细菌的相互作用对白菜生长的影响

哈茨木霉T23对白菜生长的影响及叶绿素含量变化的影响不明显,也不能提高白菜硝酸还原酶的活性;3种供试细菌放线菌、光合细菌及乳酸杆菌均能促进植物的生长,提高白菜硝酸还原酶的活性,白菜叶绿素含量明显偏低;哈茨木霉T23与3种供试细菌两两混合使用对白菜的促生效果均比单独使用各供试细菌的效果明显,硝酸还原酶活性明显增加,白菜叶绿素含量明显偏低.哈茨木霉T23和3种供试细菌两两混合使用,4种供试菌的含量均比单独使用时显著增加.     

蛇足石杉内生真菌Shiraia sp. Slf14中III型聚酮合酶的表达、纯化及生物信息学分析

竹红菌素是我国特有的一类苝醌类光敏色素,在开发新型抗肿瘤抗病毒药物、光敏活性农药及新型光电转换材料等方面应用前景广阔.聚酮合酶（ Polyketide synthase,PKS）是合成竹红菌素的一种关键酶,通过全基因组测序及分析发现在Shiraia sp. Slf14中存在一个III型聚酮合酶基因.利用RT-PCR技术,以其总RNA为模板,扩增得到目的片段,并成功构建表达载体pET-22b（+）-PKSIII,采用Ni-NTA亲和层析法纯化目的蛋白,在大肠杆菌BL21（ DE3）中成功表达出了目的蛋白,SDS-PAGE结果显示表达重组产物分子质量约为43 kDa,与理论值一致,为III型聚酮合酶的催化活性研究提供理论依据.     

绿色木霉EG Ⅲ基因的克隆及其在工业酿酒酵母中的整合表达

通过RT-PCR从绿色木霉AS3.3711中克隆得到EG Ⅲ基因,序列分析显示该基因编码序列全长为1 257 bp,编码418个aa,且自身带有21个aa的信号肽序列,与里氏木霉eg3的同源性为99.6%.将该基因连入酿酒酵母多拷贝整合型表达载体pScIKP中获得重组质粒,线性化后电转化酿酒酵母工业菌株AS2.489,通过SDS-PAGE蛋白电泳、刚果红染色和酶活测定对转化子进行了分析.结果表明:转化子有明显的重组EG Ⅲ表达带,能够产生CMC水解圈,说明eg3基因已在酿酒酵母中获得了正确的分泌表达,表达EG Ⅲ的重组菌产酶高峰出现时间为60 h,最高酶活接近120 U/mL,重组酶EG Ⅲ的最适温度为60 ℃,最适pH为6.0,转化子的遗传稳定性达到99.17%,实现了绿色木霉eg3基因在工业酿酒酵母中的稳定高效表达.     

多不饱和脂肪酸与红冬孢酵母低温适应性的关系研究

以一株产油酵母——红冬孢酵母(Rhodosporidium kratochvilovae)YM25235作为出发菌株,分析其低温生长适应性与细胞膜流动性、膜脂脂肪酸含量的变化和多不饱和脂肪酸合成关键基因——Δ12-脂肪酸脱氢酶基因mRNA表达水平的关系.结果显示,YM25235在5～35 ℃温度条件下均能生长,最适生长温度为30 ℃.低温条件下细胞膜流动性明显降低,但是多不饱和脂肪酸质量分数由从30 ℃时的24.35%增加到15 ℃时的40.32%,而且15 ℃时Δ12-脂肪酸脱氢酶基因mRNA水平提高了3.4倍.结果说明低温条件下细胞膜流动性下降,导致多不饱和脂肪酸合成相关基因表达水平提高,使得细胞膜脂中多不饱和脂肪酸含量增加,促进了菌株低温生长适应性.