Xanomeline新型衍生物SBG-PK-014促进APPsw的α-剪切

研究了xanomeline新型衍生物SBG-PK-014对毒蕈碱型M1乙酰胆碱受体的激活能力以及对APP基因瑞典型突变体(APPsw)的α-剪切的作用.利用M1激动剂筛选细胞模型检测了SBG-PK-014的EC_(50)和最大响应倍数(FA_(max)),并在小鼠神经母细胞瘤N2a细胞中同时过表达APPsW和M1受体分析了该化合物和xanomeline对sAPPα分泌的影响.结果显示,SBG-PK-014的EC_(50)(40.2 nmol/L)与xanomeline(28.4 nmol/L)接近,但FA_(max)是xanomeline的3.5倍.SBG-PK-014通过激活M1受体促进APPsW的α-剪切,且在0.1μmol/L和1μmol/L的浓度下,其效果显著强于同剂量的xanomeline.可见,SBG-PK-014比xanomeline更能有效地激活M1受体,还能促进APPsW的α-剪切和神经保护性sAPPα的生成,在调节阿尔茨海默病的Aβ病理途径上可能有一定潜力,值得进一步研究.     

原小檗碱类多靶点抗老年性痴呆症药理作用

 原小檗碱是一类异喹啉生物碱,具有相同的药效基团。本研究检测了以小檗碱和四氢黄藤素为代表的原小檗碱多靶点抗AD效应及分子作用机制。以人神经母细胞瘤SH SY5Y为研究对象,利用Western blot检测药物对细胞全长APP和BACE1蛋白水平的影响;ELISA技术检测细胞外可溶性淀粉样前体蛋白α (sAPPα) 的分泌;酶活性检测试剂盒检测乙酰胆碱酯酶 (AChE) 的活性。结果显示,药物处理细胞24 h后,二者均能显著地抑制BACE1蛋白的表达,并可使sAPPα的分泌显著增加,但未见细胞APP蛋白含量明显变化,同时对该细胞的AchE的活性具有显著的抑制作用。以上结果证明：原小檗碱生物碱药理活性涉及预防和减少Aβ沉积和增强乙酰胆碱对脑胆碱受体的作用,并通过细胞自身的代谢增加具有神经营养作用的sAPPα的分泌。提示此类化合物具有多靶点抗老年痴呆的潜能,通过结构优化改造,将有望获得副作用小的新一代抗AD有效药物。     

SNX12调控BACE1的细胞内定位和Aβ的产生

不溶性β淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)的沉积是阿尔茨海默症(Alzheimer′s disease,AD)的中心环节,Aβ是由β-分泌酶(BACE1)和γ-分泌酶顺序切割β淀粉样蛋白前体蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)产生的,BACE1与APP在质膜、内含体/溶酶体、高尔基体反面膜囊(TGN)以及早期分泌途径之间的转运很大程度上影响了Aβ的产生.通过Western blot和免疫荧光的方法探讨了Sorting nexin12(SNX12)对Aβ产生的影响及其作用机制.Western blot结果显示过表达SNX12后,分泌到细胞外的Aβ减少,γ-分泌酶的活性及PS1、NCT、pen-2、APP和BACE1的蛋白水平没有明显变化,APP-βCTF水平降低,而下调SNX12时Aβ水平增加,与对照组相比,差异均具有统计学意义(p<0.05);免疫荧光结果表明,SNX12与BACE1在细胞内存在共定位,并且SNX12表达增加可以使BACE1和APP在细胞内处于同一区域的数量减少.这些结果表明,过表达SNX12通过调节BACE1在细胞内的定位,使细胞内处于同一区域的BACE1与APP的数量减少,导致经BACE1切割的APP减少,从而降低Aβ的产生.因此SNX12可能在AD的发病过程中起着一定的调节作用.     

Physagulin H通过阻断NF-κB和JNK/MAPKs信号通路抑制LPS诱导RAW 264.7细胞产生的炎症反应

采用脂多糖诱导的RAW 264. 7巨噬细胞体外炎症模型评价physagulin H的抗炎活性.以MTT法评价细胞毒性,Griess法检测NO的含量,ELISA法检测PGE2和TNF-α水平,Western Blot法检测炎症蛋白表达(iNOS和COX-2)以及对NF-κB炎性信号通路(IκB-α蛋白降解)和对MAPKs通路(JNK,p38和ERK蛋白磷酸化)的调控作用,研究physagulin H的抗炎活性及作用机制.结果表明,physagulin H可显著降低巨噬细胞RAW264. 7中NO、PGE_2和TNF-α的释放,还可显著降低iNOS和COX-2蛋白的高表达且呈浓度依赖性.Physagulin H对LPS诱导NF-κB/IκB-α降解具有显著抑制作用.进一步的抗炎机制研究表明,physagulin H能抑制JNK磷酸化,但对ERK 1/2和p38磷酸化无明显抑制作用.综上,physagulin H是通过调控NF-κB和JNK/MAPKs信号转导通路下调LPS诱导的炎性蛋白的高表达,进而抑制小鼠巨噬细胞产生和释放过量炎症介质以及炎症因子,从而发挥抗炎作用.     

LncRNA MEG8影响结肠癌细胞恶性进展

目的 探究lncRNA MEG8对结肠癌细胞增殖、侵袭和凋亡的作用,阐明其作用机制.方法 利用实时荧光定量PCR(Real Time-Quantitative PCR,RT-qPCR)检测MEG8和miR-1827表达;Western blotting和CCK-8检测蛋白表达和细胞增殖;Transwell和流式细胞术检测细胞侵袭和凋亡;双荧光素酶报告基因试验和RNA免疫沉淀反应(RNA Immunoprecipitation,RIP)验证MEG8与miR-1827结合.结果 MEG8通过结合miR-1827负调控miR-1827表达.与人正常结肠上皮细胞相比,MEG8在结肠癌细胞中表达下调,而miR-1827表达上调.过表达MEG8或干扰miR-1827抑制HT29细胞增殖和侵袭,促进凋亡.沉默miR-1827逆转干扰MEG8诱导的细胞增殖和侵袭上升,凋亡和细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)/c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)通路活性下降.结论 Ln-cRNA MEG8通过下调miR-1827,促进ERK/JNK通路活性,阻碍结肠癌细胞HT29增殖和侵袭,促进凋亡.     

MEKK3蛋白K391位点突变对其影响的生物信息学分析及活性鉴定

MEKK3是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族的重要成员,主要参与激活c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinases, JNK)和细胞外调节(extracellular regulated protein kinases, ERK)两条通路。利用生物信息学分析野生型MEKK3(MEKK3WT)及突变型MEKK3(MEKK3K391M)蛋白的理化性质、亲/疏水性、跨膜区、二/三级结构、相互作用蛋白等。结果表明,MEKK3K391M蛋白的稳定性增强,亲/疏水性最强位点未改变,α-螺旋、β-折叠及蛋白结合位点与MEKK3WT不同。三级结构分析显示,MEKK3K391M空间位阻增大。据GenBank提供的人源MEKK3的cDNA序列(NM_203351),扩增出野生型MEKK3WT目的基因,用重叠延伸PCR定点突变技术扩增突变型MEKK3K391M目的基因,并将其克隆至带有FLAG标签的真核表达载体pCMV-tag-2c中。DNA序列分析结果表明,MEKK3K391M基因序列成功将编码赖氨酸(Lys, K)的密码子AAG突变为编码甲硫氨酸(Met, M)的密码子ATG;免疫印迹分析显示,MEKK3WT、MEKK3K391M重组体均在PC12细胞中高效表达;MEKK3WT可以激活JNK,使JNK发生磷酸化反应,其条带灰度值明显高于对照组和MEKK3K391M组。MEKK3K391M组的P-JNK与对照组相差不大。总之,MEKK3中K391的氨基酸突变引起了蛋白结构和功能的改变,特别是三级结构的空间位阻加大,使MEKK3K391M与ATP结合能力减弱,从而无法呈递磷酸基团催化相应的底物,失去生物学活性。本研究对寻找神经系统疾病JNK通路中与MEKK3相互作用的蛋白分子、探索蛋白相互作用机制提供实验基础。     

Rac1突变重组体的构建及对JAK/STAT信号通路的影响

通过构建Rac1突变体，研究Rac1激活对肾小球系膜细胞(MES)JAK2/STAT3信号通路的影响.以Rac1目的基因为模板，在引物中设计突变，扩增突变体Rac1(G12V)的目的基因，与PiggyBac(PB-FLAG)载体质粒连接，构建突变重组体PB-Rac1(G12V),并运用脂质体核酸试剂转染系膜细胞.比较正常组、Rac1(G12V)突变组中系膜细胞的ROS含量及NADPH氧化酶活性；Elisa法检测细胞因子TGF-β表达水平；Western blot法检测系膜细胞中JAK2/STAT3信号及FN蛋白的表达.结果表明，成功构建了Rac1(G12V)持续磷酸化突变体并在MES细胞中表达，与正常组相比，Rac1(G12V)激活突变MES细胞NADPH氧化酶的活性和ROS含量明显增加；JAK2/STAT3信号通路激活，TGF-β和FN表达明显增加.Rac1能激活系膜细胞氧化应激和JAK2/STAT3信号通路，并促进TGF-β及FN的表达.     

丹参酮ⅡA对UVA诱导的HaCaT细胞凋亡的影响

以人自发性永生化角质形成细胞系(HaCaT)细胞为材料, 通过CCK8和蛋白印迹法分别测定不同剂量长波紫外线(ultraviolet A, UVA)、不同浓度丹参酮ⅡA(tanshinone ⅡA,TSⅡA), 以及UVA和TSⅡA共同作用下的细胞活力和促分裂素原活化蛋白激酶(mitogenactivatedprotein kinase, MAPK)信号通路蛋白(p38, JNK和Erk)磷酸化水平. 结果表明:在10 J/cm2的UVA照射下, 细胞活力为对照组的70%左右, 在20 J/cm²的UVA照射下, 细胞活力仅为对照组的55%左右; 低浓度的TSⅡA在正常情况下对细胞活力无影响, 高浓度(85 μmol/L) TSⅡA处理组的细胞活力约为对照组的70%左右. 与TSⅡA或UVA单独处理相比, 二者共同作用下细胞活力大大降低且差异极其显著. UVA照射提高了MAPK信号通路中的p38和JNK磷酸化水平, 但是对Erk磷酸化水平没有影响; 而TSⅡA可以显著提高低辐射剂量(2 J/cm²)UVA诱导下的p38和JNK的磷酸化水平. 这说明UVA促进HaCaT细胞凋亡是通过提高p38和JNK磷酸化水平来实现的; 而TSⅡA可以提高p38和JNK磷酸化水平,进一步加速UVA诱导的HaCaT细胞凋亡.     

CCL18与TGF-β促进乳腺癌EMT的比较

目的:研究比较CCL18与β转化生长因子(TGF-β)促进乳腺癌细胞上皮间质化(EMT)的分子机制,从而进一步明确靶向CCL18和TGF-β所激活的信号通路,抑制乳腺癌浸润迁移的分子靶点.方法:设计并合成针对CCL18的受体基因PITPNM3的特异性siRNA,利用脂质体携带siRNA转染乳腺癌MCF-7细胞,沉默PITPNM3的表达,分别用CCL18和TGF-β处理乳腺癌细胞,用免疫荧光和western blot的方法检测EMT的特异性标志物E-cadherin和Vimentin表达的变化以及Smad2和Smad3的磷酸化状态.结果:PITPNM3-siRNA转染MCF-7细胞24 h后,用CCL18或TGF-β分别处理乳腺癌细胞4 d,western blot证明CCL18不能磷酸化激活Smad2和Smad3,TGF-β磷酸化激活Smad2和Smad3促进乳腺癌EMT,沉默PITPNM3表达,western blot和免疫荧光证明不影响TGF-β促进乳腺癌EMT.结论:TGF-β通过Smad2/smad3磷酸化激活促进乳腺癌EMT,不通过CCL18的受体PITPNM3发挥作用.     

过氧化物酶体增殖物激活受体γ在淀粉样前体蛋白（APP）加工和β-淀粉样蛋白介导的细胞死亡中的作用

最近的数据显示,过氧化物酶体增殖物激活受体γ（Peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ）可参与导致阿尔茨海默氏症（Alzheimer＇s disease,AD）的淀粉样级联的调节。在本研究中我们证明了的PPARγ在培养的细胞中过表达,急剧减少了β-淀粉样蛋白（Amyloid-β,Aβ）的分泌,在转录后水平影响淀粉样前体蛋白（Amyloid precursor protein,APP）的表达。APP下游调节不涉及分泌酶的通路而与对APP泛素化的显著诱导有关。此外,我们还证明了PPARγ能通过降低Aβ的分泌从而保护过氧化氢诱导的细胞坏死。综合起来,我们的研究结果表明了一种新型机制：PPARγ激动剂对神经元的保护作用和由于Aβ的积累所造成的致病作用的机制。