Pseudomonas syringae褐藻胶裂解酶基因的克隆及信息学分析

以Pseudomonas syringae的基因组为模板,使用褐藻胶裂解酶引物进行PCR扩增,将目的基因克隆至p MD18-T载体后进行测序.结果显示,克隆基因的大小为1137 bp,预测编码含有378个氨基酸残基的蛋白质.对该蛋白质进一步进行生物信息学分析,结果表明,该蛋白质序列与其他菌株来源的褐藻胶裂解酶具有高的相似性,预测本研究克隆的基因编码褐藻胶裂解酶.该褐藻胶裂解酶的理论分子质量为42.5 ku,理论等电点为8.15.采用同源建模法建立P.syringae褐藻胶裂解酶的三维结构,富含螺旋结构.     

产微球茎菌琼胶酶基因的克隆及生物信息学分析

以琼脂为唯一碳源的培养基分离出一株产琼胶酶的海洋菌株AG1,16S rRNA基因序列分析显示,该菌株为产微球茎菌（Microbulbifer sp.）。以菌株AG1的基因组为模板,使用琼胶酶特异性引物进行PCR扩增,将扩增产物克隆至pMD18-T载体后进行测序。结果显示,克隆基因的大小为1302 bp,预测编码含有433个氨基酸残基的蛋白质。对该蛋白质进行生物信息学分析,结果表明,该蛋白质序列与来自耐热微泡菌（Microbulbifer thermotolerans）的琼胶酶氨基酸序列相似性为100%,预测本研究克隆的基因编码琼胶酶。该琼胶酶的理论分子质量大小为48.2 ku,理论等电点为5.42。采用同源建模法建立Microbulbifer sp.AG1琼胶酶的三维结构,富含β-折叠。     

蜡质芽孢杆菌酰基高丝氨酸内酯酶基因的克隆及序列分析

利用pMD18-T克隆载体从蜡质芽孢杆菌菌株T—HW3中克隆了酰基高丝氨酸内酯酶基因（AHL—lactonase，aiiA）。测序结果表明，该基因（GenBank登录号为DQ000643）由753个碱基组成，编码含有250个氨基酸残基的蛋白质。该蛋白质的推测的分子量为28kDa，等电点为4．235左右。核苷酸序列的BLAST分析结果表明，与之同源性较高的基因均为蜡质芽孢杆菌组aiiA基因（86％-99％）。     

微泡菌ALW1褐藻胶裂解酶AlgL14的表达及信息学分析

以微泡菌(Microbulbifer sp.) ALW1的基因组为模板,使用褐藻胶裂解酶AlgL14特异性引物进行PCR扩增,将扩增产物克隆至p MD18-T载体后进行测序,并对该基因编码的蛋白质序列进行生物信息学分析。将目的基因插入pET-28α(+)表达载体,转入Escherichia. coli BL21 (DE3)中进行诱导表达,并利用亲和层析进行重组蛋白纯化。结果显示,克隆基因的大小为1 350 bp,预测编码含有449个氨基酸残基的蛋白质。该蛋白质序列与其他菌株来源的褐藻胶裂解酶序列具有一定的相似性,预测克隆的目的基因编码褐藻胶裂解酶,归属于PL-14家族。褐藻胶裂解酶AlgL14的理论分子质量大小为48. 772 ku,理论等电点为6. 27。采用同源建模法建立菌株ALW1褐藻胶裂解酶AlgL14的三维结构,富含β-折叠。将目的基因在E. coli BL21 (DE3)中进行诱导表达,并纯化获得重组褐藻胶裂解酶。SDS-PAGE分析显示,表达的目的蛋白分子质量约为48. 8 ku。     

海洋球石藻病毒甾醇去饱和酶基因的克隆与表达

以海洋球石藻(Emiliania huxleyi)病毒EhV-99B1基因组为模板,用一对病毒甾醇去饱和酶(sterol desaturase,SD)基因的特异性引物进行PCR扩增,获得EhV-SD基因,将扩增产物克隆至pMD19-T载体后进行测序,并对该基因编码的蛋白质序列进行生物信息学分析。将测序正确的目的基因亚克隆入酿酒酵母表达载体pYES2/CT中,转化酿酒酵母缺陷型菌株YMR015C,并用D-半乳糖诱导表达,提取重组酵母和野生型酵母细胞总脂并进行薄层色谱(thin layer chromatography,TLC)分析。结果显示:EhV-SD基因全长为987 bp,编码328个氨基酸,该蛋白质的理论等电点为8.31,预测的蛋白质分子质量为37.83 ku,为疏水性、不稳定蛋白质,存在6个跨膜结构域,不存在信号肽;其二级结构中,α-螺旋含量最多。氨基酸序列比对结果显示,EhV-SD基因与宿主球石藻及金色藻属(Chrysochromulina sp.CCMP 291)亲缘关系较近。TLC结果表明,EhV-SD基因的表达导致酵母细胞极性较强的脂类明显减少,而极性较弱的脂质成分显著增加,表明EhV-SD具有一定的催化活性。     

地芽孢杆菌(Geobacillus)YHL的全基因组测序及序列分析

该文采用Illumina 高通量测序技术对地芽孢杆菌(Geobacillus sp. YHL)进行全基因组测序,使用Velet软件进行组装,利用Glimmer软件对菌株进行基因预测,得到的蛋白质通过与COG、KEGG等数据库进行比对来获得相应的注释信息.利用多种绘图工具对注释信息进行汇总及分析,获得了COG、KEGG等多种基础注释信息,对这些信息进行挖掘分析,研究结果发现:该菌株具有多种编码酶基因,包括糖苷水解酶、葡糖苷酶、木聚糖酶、淀粉酶、新普鲁兰酶、支链淀粉酶和脂肪酶,是一种嗜热的多酶编码菌,有一定的应用潜力.重点关注了在基因组中编码热应激蛋白基因,这些基因信息最终可以提供关于细菌的热适应机制的初步解释.     

微泡菌ALW1几丁质酶Chi18A的克隆及信息学分析

以微泡菌(Microbulbifer sp.)ALW1的基因组为模板,利用几丁质酶基因的特异性引物进行PCR扩增,然后将产物插入到pMD18-T载体后进行DNA序列测定,并对目的基因编码的蛋白质序列进行信息学分析。结果显示,克隆的目的基因大小为1644 bp,预测编码含有547个氨基酸残基的蛋白质。该蛋白质序列与其他菌株来源的几丁质酶序列具有70%左右的相似性,表明预测目的基因编码几丁质酶。该蛋白质具有2个几丁质结合结构域和1个GH18家族酶的催化结构域,属于糖苷水解酶(glycoside hydrolase,GH)家族18,命名为几丁质酶Chi18A。模拟的三维结构显示,Chi18A含有(βα)_8桶状结构。     

基因功能研究新技术———新的晶体解析方法

建立了包含 5 0 0多种筛选条件的蛋白结晶系统 ,提高了获得蛋白晶体的概率 .目前 ,已对 3种新基因编码蛋白进行晶体培养 ,其中一种新基因蛋白已经得到单晶 ,为解析该蛋白结构做好了准备 .同时 ,结合已建立的大规模蛋白原核分泌表达与纯化技术系统 ,将对大量新基因编码蛋白进行晶体培养条件的筛选 ,为大规模结构生物学研究和新基因功能 结构关系分析奠定了基础 .已成功制备了耐热邻苯二酚 2 ,3 双加氧酶、耐热碱性磷酸酯酶的蛋白质晶体 ,并收集了Ｘ 衍射数据 .在国内首次获得了硒化耐热邻苯二酚 2 ,3 双加氧酶的晶体 ,在日本的同步辐射光源上…     

虎纹蛙病毒的ATP酶基因克隆和序列分析

利用对应于蛙病毒—3型(FV3）ATP酶基因(ATPase)的162—178nt和1186—1174ntt碱基序列作为引物，采用PCR方法扩增得到虎纹蛙病毒(RTV)的ATP酶基因，并对该基因进行克隆、测序和分析。基因读码框大小为945hp，预计可编码一相对分子质量为35500的蛋白质。氨基酸序列比较结果，RTV的ATPase基因与虹彩病毒科蛙病毒属的代表种FV3的一致性最高，为87．9％，与该科其它脊椎动物病毒的一致性在50％-52％之间。ATP酶蛋白质结构域分析可知该基因编码的ATP酶含有Walker型ATP酶AAA族蛋白质的全部结构域，其中既具有Walker型ATP酶所具有的Walker a和Walker b保守区，还含有AAA族蛋白质基因所具有的SRH高度保守区，因此，该基因是一完整的活性蛋白编码基因。     

曼氏无针乌贼SCD蛋白结构和功能预测

采用了BLASTp,ProtScale等蛋白质和核酸序列分析软件和数据库对曼氏无针乌贼SCD基因编码的蛋白进行了蛋白质结构域,螺旋卷曲结构等生物信息学分析。结果发现该基因编码的蛋白质为碱性跨膜蛋白质,该蛋白质可能为脂肪酸代谢起到关键调控作用,有进一步研究的价值。     

鹅细小病毒CHv强毒株VP3基因克隆及遗传进化

根据Genbank中的鹅细小病毒(GPV)B株全基因序列,设计合成一对引物,应用PCR技术扩增了GPV强毒株CHv的VP3基因片段,将扩增后的VP3基因重组到pMD18-T质粒载体上,并对插入片段进行序列测定,将测序结果及由该结果推导的氨基酸序列与国内外分离的GPV、MDPV、PPV和CPV等不同宿主的细小病毒的VP3进行比对分析。结果表明:中国四川分离的GPV CHv株VP3基因长1 605 bp,编码534个氨基酸,与国内外10株GPV的VP3基因进行比较,核苷酸同源性为93.4%~99.8%,氨基酸同源性为96.5%~99.3%,其变异较小,是GPV保持一个血清型的分子基础。与番鸭细小病毒的核苷酸和氨基酸同源性分别为79.6%和89.9%,而与其他种属的细小病毒同源性均在30%以下,表明它们与GPV CHv株亲缘关系较远。     

新疆绵羊种布鲁氏菌GroEL基因的克隆及序列分析

参考牛种布鲁氏菌的GroEL（热休克蛋白）基因设计引物,扩增出新疆绵羊种布鲁氏菌GroEL基因片段,将其片段克隆到T载体上测序。结果表明：新疆源布鲁氏菌GroEL基因片段长1641bp,编码546个氨基酸,与羊种（B．melitensis）、猪种（B．suis）以及牛种（B．abortus）GroEL基因的核苷酸序列同源性分别为99．88％、99．82％、99．88％,推导的氨基酸序列同源性在99％以上,显示了很强的保守性。     

中蜂囊状幼虫病病毒部分结构蛋白基因的克隆及序列分析

根据小ＲＮＡ 病毒科（ Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ） 中病毒ＲＮＡ 所具有的结构特征, 采用ｍＲＮＡｃａｐｔｕｒｅ ｋｉｔ 提取纯化中蜂囊状幼虫病病毒（Ｃｈｉｎｅｓｅｓｃａｂｒｏｏｄ ｖｉｒｕｓ ＣＳＢＶ） 的ＲＮＡ, 并以之为ｃＤＮＡ合成的模板． 依据小ＲＮＡ病毒科中的脊髓灰质炎病毒结构蛋白基因序列设计了一对引物ＶＰ５和ＶＰ３ , 通过ＰＣＲ 扩增获得预期大小约为１ １００ ｂｐ的ＤＮＡ 片段, 将此片段克隆到ｐＧＥＭＴｅａｓｙ载体上并直接测序． 序列分析表明, 该片段为中蜂囊状幼虫病病毒部分结构蛋白基因, 与意蜂幼虫囊状病病毒结构蛋白基因序列的同源性为８６－８ ％ , 与之对应氨基酸序列的同源性高达９３－４ ％ ． 该病毒株为一种新型的蜜蜂囊状幼虫病病毒株     

PRV广东株gE基因去信号肽片段的克隆与序列测定

根据伪狂犬病病毒（PRV）Rice株gE基因的序列设计并合成了1对引物,以我国PRV地方毒株广东株的基因组DNA为模板,通过PCR方法获得了一大小约1.6kb的DNA片段,并将其克隆到pMD18-T载体上进行测序,序列测定结果显示,该片段长1665bp,编码555个氨基酸,与PRV Rice株gE基因的核苷酸序列同源性为97.7%,氨基酸序列同源性为95.9%。     

A组乙型溶血性链球菌DNaseB基因亚克隆及pET-28a(+)-DNaseB载体构建

运用PCR扩增技术,以质粒pMD18-T-DNaseB为模板,扩增出0.5 kb截短的DNaseB基因,先将该基因片段与pMD19-T载体连接,确定该序列正确并进行大量繁殖后,再将DNaseB基因定向克隆入pET-28a( )表达载体中,构建新的原核表达载体pET-28a( )-DNaseB,转化该重组质粒至受体菌E.coliDH5a中,采用SDS碱裂解法提取该质粒DNA,经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定和核苷酸序列分析,证实插入的基因片段具有正确的DNaseB基因核苷酸序列,将pET-28a( )-DNaseB转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经过IPTG诱导其目的蛋白得到了表达.     

Kas基因启动子区的克隆及功能初步分析

利用TAIL-PCR技术,克隆到了与辣椒素合成有关的胎座特异表达基因——3-酮酯酰．ACP合成酶基因（Kas）上游400bp的调控区域．将其全长片段与GUS基因连接构建植物表达载体并转化烟草．GUS组织化学染色表明,克隆到的440bp片段具有启动子活性．对该片段进行序列分析发现,在起始密码子ATG上游存在2个TATA-box,分别为-316～-311位的TATAAA和-224～-219位的TATAAA;在TATA-box上游还存在1个位于-378～-374处的CAAT-box,序列为CCAAT．该研究旨在为利用基因调控辣椒素的生物合成,提高辣椒果实中的辣椒素含量奠定基础．     

赤红球菌JDM312株环己酮单加氧酶基因的克隆和序列分析

应用PCR从赤红球菌JDM312株基因组DNA中扩增出chnB基因序列,构建pUC18-chnB重组质粒,转化大肠杆菌DH5α,并对插入片段进行测序,用Clustal X和Mega 3.1软件对测定DNA序列进行相似性和系统发育分析.结果显示：扩增得到的chnB基因大小为1 623 bp,编码由542个氨基酸残基构成的...     

人肥胖(obese)基因的人工合成及克隆

根据人肥胖基因的cDNA序列，通过合理的引物设计、链延伸反应、PCR反应以及分子克隆等步骤，成功地合成出编码瘦蛋白（Leptin）的肥胖基因（oB基因）全长片段，并将其克隆至PUc18载体质粒上．序列分析和酶切鉴定显示肥胖基因得到了正确合成和克隆．     

大麦醇溶蛋白基因片段克隆和RNAi植物表达载体构建

 为了降低啤酒大麦蛋白的含量,提高啤酒大麦品质,利用甘肃推广面积最大的品种甘啤4号为材料,克隆大麦醇溶蛋白基因保守区序列,构建RNAi表达载体。根据已知大麦醇溶蛋白基因保守序列设计一对特异性引物B2PF5′-CAACCATTTCCACAGCAACCACCAT-3′,B2PR5′-GAAAGATAGAGTAGACGATTGCACG-3′,采用PCR技术从甘啤4号大麦基因组中获得了1个349bp片段（GP4）。依据载体pHANNIBAL和pART27的结构,分别将GP4按所对应酶切位点正反向插入,利用热激法转化。结果分析显示,克隆出的片段与GenBank （NCBI）中醇溶蛋白基因核苷酸序列同源性高达92%,所构建成的RNAi表达载体pART27-pHAN-GP4中含目标片段。