应用16S rRNA基因序列分析青海放牧牦牛瘤胃细菌多样性

以青海省海北藏族自治州刚察县全放牧牦牛瘤胃内容物为样本,使用细菌通用引物进行瘤胃细菌16S rRNA基因序列的扩增,以16S rRNA序列分析技术分析牦牛瘤胃细菌多样性,并构建16S rRNA基因克隆文库。结果表明:获得114个非嵌合体序列属于93个OTUs(相似性≥97%作为一个OTUs),其中64个OTUs与已知16S rRNA序列相似性≥97%,占总代表序列的68.82%;有27个OTUs与已知16S rRNA序列相似性处于90%~96%,占总代表序列的29.03%;有2个OTUs与已知16S rRNA序列相似性90%,占总代表序列的2.15%。这93个OTUs序列已向Genebank提交,序列号为(KP455685~KP455713,KP765451~KP765514)。将93个OTUs代表序列与已知序列构建系统发育树的分析表明,青海放牧牦牛瘤胃细菌主要分为LGCGPB(the low G+C Gram positive bacteria)和CFB(the Cytophaga-Flexibacter-Bacteroides group)两大类;而瘤胃内纤维降解菌主要属于LGCGPB这一类。同时在瘤胃内容物中还检测到了14株已培养瘤胃细菌,其中6株属于纤维降解菌,说明了全放牧条件下牦牛瘤胃内纤维降解菌的优势地位。     

纤维素降解混合培养物的16S rRNA基因序列分析

以牦牛瘤胃内容物为接种物,以滤纸为唯一碳源富集到一个降解纤维素的混合培养物.构建混合培养物的16S rRNA基因文库,共获得49个序列,分为7个OTU.其中19个序列与已培养细菌的16S rRNA基因相似性97%,占总序列的38.8%;2个古菌的序列与甲烷菌的16S rRNA基因相似性分别为99%和98%,占总序列的4.1%;28个序列属于未培养细菌,占总序列的57.1%.未培养的序列形成4个独立的系统发育分支,其中3个未培养分支与在其他环境中的黏附在纤维素上的瘤胃细菌的16S rRNA基因序列相似性97%,推测这3类微生物可能与纤维素降解相关.     

纤维素降解混合培养物的16S rRNA基因序列分析

以牦牛瘤胃内容物为接种物,以滤纸为唯一碳源富集到一个降解纤维素的混合培养物.构建混合培养物的16S rRNA基因文库,共获得49个序列,分为7个OTU.其中19个序列与已培养细菌的16S rRNA基因相似性>97%,占总序列的38.8%;2个古菌的序列与甲烷菌的16S rRNA基因相似性分别为99%和98%,占总序列的4.1%;28个序列属于未培养细菌,占总序列的57.1%.未培养的序列形成4个独立的系统发育分支,其中3个未培养分支与在其他环境中的黏附在纤维素上的瘤胃细菌的16S rRNA基因序列相似性>97%,推测这3类微生物可能与纤维素降解相关.     

内蒙古白绒山羊不同放牧期瘤胃甲烷菌mcrA基因的RFLP分析

分析不同放牧期内蒙古绒山羊瘤胃中甲烷细菌的种群组成.选取甲烷菌mcrA基因的特异性引物序列,对瘤胃液中提取的细菌总DNA进行PCR扩增,建立甲烷细菌特异性的mcrA基因文库.用限制性内切酶TapⅠ对该文库特异性片段进行限制性内切片段长度多态性分析(RFLP).结果表明牧草生长幼嫩期、旺盛期和枯草期随机挑选的特异性克隆片段分别为115、105和112,分成6个RFLP类型,每期的不同类型占了所有分析克隆子的比例分别为36%、28%、20%、3.5%、3.5%和9%;38%、27%、18%、7%、5.5%和4.5%;35%、24%、18%、6.5%、3%和13.5%.     

天然草地放牧条件下牦牛瘤胃消化代谢的研究

为研究牦牛(Bos grunniens)瘤胃消化代谢的特点和基本规律。选用五头装置永久性瘤胃瘘管的成年健康母牦牛,在高山草地放牧条件下,按牧草生长季节节律,测定了嫩草期、保青期、青枯期瘤胃液pH值、总挥发性脂肪酸(TVFA)和氨氮(NH_3—N)的含量,以及昼夜动态变化。结果表明:牦牛在高海拔、少氧、寒冷、昼夜温差大等终年放牧无棚圈条件下,其瘤胃消化代谢昼夜变化呈一定规律性:pH、NH_3—N含量白天高于夜间,而TVFA水平则呈相反变化。不同生长期的牧草对瘤胃NH_3—N、VFA有较大影响。每100ml瘤胃液中:NH_3—N含量从嫩草期的37.26mg降至保青期的22.21mg和青枯期的22.74mg,嫩草期与保青期、青枯期差异极显著(P<0.01)。每100ml瘤胃液中:TVFA浓度,由嫩草期的11.21mM和保青期的7.69mM增至青枯期的15.22mM,嫩草期、青枯期与保青期差异极显著(P<0.01)。牦牛瘤胃液pH值偏硷性,三期间差异不显著(P>0.05)。牦牛VFA组分中,乙酸较高,而丙酸偏低,呈乙酸型发酵,保青期尤为突出。异戊酸和已酸水平比例偏高。     

珠江口海岸带沉积物甲烷相关古菌群落结构及多样性研究

用构建克隆文库的方法对珠江口沉积物中4个层位的甲烷相关古菌群落多样性特征进行研究.结果表明甲烷相关古菌群落结构主要可以分为3类,分别为Methanosaeta,Methanomicrobiales和Methanosarcinales/ANME,且其组成随沉积物深度的改变发生规律变化.Methanosaeta和Methanomicrobiales是属于乙酸和H2/CO2利用型甲烷产生菌,在克隆文库中的含量随沉积物深度的增加而减少;Methanosarcinales/ANME主要由甲烷氧化菌和甲基利用型甲烷产生菌组成,在克隆文库中的含量随沉积物深度的增加而增加.甲烷相关古菌群落结构的变化规律说明,在SMTZ区域及以上,甲烷产生以H2/CO2和乙酸型为主;在SMTZ区域以下,以甲基利用型为主;在SMTZ区域,主要是甲烷氧化过程,由古菌类群ANME-2a负责.     

生物砾间接触氧化反应器中原核生物多样性及其对剩余污泥减量化的贡献

采用分子生物学手段，通过构建16S rRNA基因文库，对新型剩余污泥减量化处理技术——生物砾间接触氧化反应器 （GCOR） 中悬浮颗粒的原核生物多样性进行了系统发育分析，并讨论了多种原核生物共存对剩余污泥减量化的贡献. 结果表明，颗粒的原核生物可分为好氧呼吸菌群与厌氧水解发酵菌群两大类. 其中，优势菌群分别是以呼吸代谢为主的假单胞菌属和以发酵为主要代谢方式的拟杆菌/噬纤维菌菌属，它们的16S rRNA序列各占文库的17%.此外，好氧菌群中还发育有α蛋白菌、β蛋白菌、γ蛋白菌、亚硝化螺菌属、土壤杆菌属、衣原体属、葡萄糖杆菌属及褐色高温单孢菌属细菌；厌氧菌群中则发育属于螺旋体属、δ蛋白菌、反硝化菌、乳杆菌属、真杆菌属的原核生物.反应系统中两大相反环境多种原核生物的共存，为在降解污水有机物的同时，达到剩余污泥减量化做出巨大贡献.     

鲫鱼养殖池塘底泥菌群结构及常见可培养菌分析

为了研究江苏地区鲫鱼养殖池塘底泥细菌菌群结构与多样性,通过高通量测序技术对2017年8-10月间采集的江苏省不同区域养殖池塘底泥中所有细菌的16S rRNA V3-V4基因进行扩增测定,分析了底泥菌群结构特征;并通过平板计数法和选择培养基法检测池塘底泥中细菌总数和主要常见菌。结果表明,49个样品高通量测序共获得有效序列2152956条,可归为17735个分类操作单元(OTUs);物种注释结果显示,鲫鱼养殖池塘底泥中具有较高的菌群多样性,检测到的细菌归属于29个门类,所有池塘底泥都具有主要门类为变形菌门、绿弯菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、水生古细菌门、酸杆菌门、放线菌门、硝化螺旋菌门、螺旋菌门、芽单胞菌门、蓝细菌门、浮霉菌门、疣微菌门等。在属的水平上主要以硫杆菌属,乳酸球菌属,硫氧化菌,甲烷菌,地杆菌属,假单胞菌属,厌氧粘杆菌属,甲烷绳菌属,芽孢杆菌属等为主;所有池塘底泥共有菌主要有乳酸球菌属,甲烷菌,盐单胞菌,芽孢杆菌,红杆菌属,链球菌属,肉杆菌属,微小杆菌属,土芽孢杆菌属等。通过细菌培养发现,池塘底泥中常见益生菌如乳酸菌、芽孢菌具有较高的比例。可见鲫鱼养殖池塘底泥菌群结构及组成具有多样性,不同养殖池塘中共有的细菌可作为益生菌开发的参考菌株。     

西沙野生诺尼内生细菌群落多样性初步研究

采用构建16S rDNA克隆文库方法,首次对我国海南永兴岛西沙野生诺尼果内生细菌的群落结构和多样性进行初步研究.首次采用Mothur软件对诺尼果内生细菌克隆文库数据进行分析,构建Mothur软件数据分析平台.构建的西沙野生诺尼果内生细菌16S rDNA克隆文库中,93个克隆分属于12个不同可操作分类单元(operational taxonomic units,OTU),序列比对结果表明大部分克隆与已知细菌16S rDNA序列相似性较高.分别属于变形菌门(Proteobacteria)的Alpha、Beta、Gamma亚群,放线菌门(Actinobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes).水库杆菌属(Piscinibacter sp.)细菌为野生诺尼果内生细菌优势菌群.优势菌属分别为水库杆菌属(Piscinibacter sp.)为80.65%,蛋白胨菌属(Peptoniphilus sp.)和链球菌属(Streptococcus sp.)均为3.23%,甲基杆菌属(Methylobacterium sp.)为2.15%.研究结果表明西沙野生诺尼果中存在较为丰富的内生细菌资源,将为进一步研究奠定理论基础.     

冷季补饲对幼年牦牛瘤胃发酵和血液指标的影响

通过对试验组进行放牧加补饲的方法研究了冬季补饲对幼年牦牛瘤胃发酵及血液指标的影响。结果表明,试验组和对照组牦牛日增重相差820.83 g,差异极显著（P〈0.01）;瘤胃发酵指标中pH差异不显著（P〉0.05）,试验组氨氮（NH3-N）浓度显著高于对照组（P〈0.01）,而瘤胃液蛋白含量却显著低于对照组（P〈0.01）;血液指标中TP、Glu及PUN的测定结果试验组均高于对照组,但差异不显著（P〉0.05）。     

陆梁油田菌群结构解析及激活后群落变化

 针对新疆陆梁油田呼图壁河组注水井LU3064 注入水,设计一组营养剂激活配方,该配方能够成功乳化原油。经平板计数法、最大或然数计数法（MPN）和理化性质检测发现,激活后注入水菌浓明显增加,表面张力下降37%。采用建立细菌16S rDNA克隆文库方法,对LU3064 注入水、LU3036 采出液、LU3064 激活液细菌进行多样性研究。从克隆文库中随机挑选100 个克隆子测序,并在GenBank 中比对,结果表明,注入水菌群具有高度多样性,优势菌属于Alphaproteobacteria;采出液较地层水菌群结构简单,存在Pseudomonas（假单胞菌属）、Bacillus（芽孢杆菌属）等功能菌属;激活液菌群结构最为单一,仅存在Bacillus（芽孢杆菌属）。Bacillus 在注入水和采出液中均有发现,但都不是优势菌种。该激活剂配方成功激活了可在地层中生长的功能菌属Bacillus。     

河西走廊盐碱土中未培养放线菌多样性研究

用放线菌特异性引物扩增16SrRNA基因片段构建基因的克隆文库,研究河西走廊盐碱土壤中放线菌的种群结构及多样性.结果显示,164个阳性克隆分归于50个OTUs,系统发育分析得出这50个OTUs分属于放线菌目的7个亚目,分别是丙酸杆菌亚目、假诺卡氏亚目、棒杆菌亚目、微单孢菌亚目、链霉菌亚目、微球菌亚目和链孢囊菌亚目,其中微球菌亚目为克隆文库中的优势种群,占总克隆数的37.2%.还有一部分克隆属于放线菌门的未知种群,占总克隆数的14.01%.未趋向于平缓的稀释性曲线表明该区域的盐碱土壤中放线菌多样性较高.     

造纸白水中的细菌多样性及系统发育树分析

在制浆造纸过程中,白水的循环回用加重了纸机微生物污染的问题,促进了纸机腐浆的形成,影响了纸机的正常运转。此次研究用滤膜抽滤富集细菌菌体,对白水样品直接提取DNA,通过16S rDNA序列分析,构建16S rDNA文库,对芬欧汇川(UPM)常熟纸厂PM1纸机白水中的细菌多样性进行了研究。获得的61个16S rDNA序列可分为28个可操作分类单元(OTUs),分属于6个不同门类,优势菌种顺序为变形菌门(Proteobacteria)(77.05%)、厚壁菌门(Firmicutes)(11.48%)、放线菌门(Actinobacteria)(4.92%)、异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)(3.28%)、拟杆菌门(Bacteroidetes)(1.64%)、蓝藻门(Cyanobacteria)(1.64%)。造纸白水具有较丰富的细菌多样性,以变形菌为优势菌群,占库容总量的77.05%,其中尤以β-变形菌群为主,占库容总量的45.90%,而首次在中国纸机鉴定出的水生施莱格尔氏菌(Schlegelella aquatica)为克隆文库的优势菌株,另外还含有2个菌种属于异常球菌-栖热菌门,该菌门为红色腐浆形成菌种。     

造纸白水中的细菌多样性及系统发育树分析

在制浆造纸过程中,白水的循环回用加重了纸机微生物污染的问题,促进了纸机腐浆的形成,影响了纸机的正常运转。此次研究用滤膜抽滤富集细菌菌体,对白水样品直接提取DNA,通过16S rDNA序列分析,构建16S rDNA文库,对芬欧汇川(UPM)常熟纸厂PM1纸机白水中的细菌多样性进行了研究。获得的61个16S rDNA序列可分为28个可操作分类单元(OTUs),分属于6个不同门类,优势菌种顺序为变形菌门(Proteobacteria)(77.05%)、厚壁菌门(Firmicutes)(11.48%)、放线菌门(Actinobacteria)(4.92%)、异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)(3.28%)、拟杆菌门(Bacteroidetes)(1.64%)、蓝藻门(Cyanobacteria)(1.64%)。造纸白水具有较丰富的细菌多样性,以变形菌为优势菌群,占库容总量的77.05%,其中尤以β-变形菌群为主,占库容总量的45.90%,而首次在中国纸机鉴定出的水生施莱格尔氏菌(Schlegelella aquatica)为克隆文库的优势菌株,另外还含有2个菌种属于异常球菌-栖热菌门,该菌门为红色腐浆形成菌种。     

乙醇对生物成气过程中煤地质微生物菌群结构及产气途径的影响

微生物增产煤层气是煤层气再生和赋存的有效途径,了解煤地质微生物菌群结构对促进煤层气的生物生成具有重要意义。文章旨在分析在不同乙醇浓度下褐煤厌氧发酵过程中,微生物产甲烷菌群数量、结构的动态变化及产气类型,分别添加质量分数0.5%和1%两种不同浓度的乙醇,利用褐煤进行为期90 d的厌氧发酵实验。在发酵过程中不同时间取样,通过PCR-DGGE、实时荧光定量PCR,对不同发酵阶段微生物的种类和数目进行分析。采用454焦磷酸高通量测序,进一步分析不同发酵阶段细菌及古菌菌群结构的变化,进而推测产气类型的变化。实时荧光定量PCR分析表明,随着发酵时间的延长,不论是细菌菌群还是古菌菌群的数量均有所增加。高通量测序结果显示,发酵过程中,对照组和添加0.5%和1%乙醇的实验组细菌物种组成差异不明显(P0.05)。对于古菌菌群而言,对照组和添加0.5%和1%乙醇的实验组物种组成差异明显(P0.05)。PCR-DGGE指纹图谱分析表明,样品微生物主要菌群与高通量测序结果大体一致。添加乙醇的实验组与对照组之间差异明显(P0.05),对照组中,随着发酵时间的延长,甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)逐渐增多,添加0.5%和1%乙醇的实验组中则是甲烷杆菌属(Methanobacterium)明显增加,表明乙醇的添加改变了煤地质微生物发酵的菌群结构。Candidatus-Methanoplasma、甲烷杆菌属、甲烷八叠球菌属分属不同的产甲烷菌属,表明乙醇的添加改变了甲烷生物生成的产气类型。     

基于高通量测序的液态奶中微生物多样性研究

目的 为探究不同液态奶样品中微生物的菌群组成和其多样性。方法 采用高通量测序技术对液态奶中细菌16S rRNA的V₃-V₄区进行测序,研究了四组液态奶样品在门水平和属水平的菌群结构。结果 四组样品中共有分类操作单元(Operational Taxonomic Unit, OTU)数目为119个,独有的OTU数分别占15.0%、6.85%、8.86%和12.35%。在门水平,厚壁菌门和变形菌门是四组液态奶的共有菌门,其中4组样品中厚壁菌门的相对丰度分别为38.9%、73.8%、20.9%、29.6%,变形菌门的相对丰度分别为46.9%、10.0%、28.0%、17.2%;在属水平,4组液态奶中的优势菌属分别是芽孢杆菌属、短波单胞菌属;芽孢杆菌属;Cloacibacterium和寡养单胞菌属;芽孢杆菌属、微杆菌属和异常球菌属。结论 四组样品在门水平的菌群组成基本相似。属水平上,液态奶中含有的不动杆菌属、芽孢杆菌属和克雷伯氏菌属属于嗜冷菌,这些菌属可以导致液态奶发生腐败变质等现象。这为今后探索液态奶中腐败菌防治措施提供重要依据。     

应用16SrDNA序列分析对砾石接触氧化反应器中细菌多样性

 运用分子生物学手段,对砾石接触反应器内的典型区域,包括石球表面的生物膜、石球内部污泥及反应器底部的沉淀污泥,通过DNA提取、PCR扩增、纯化与回收、TA克隆、序列测定,基因比对等方法,对反应器内的细菌多样性进行分析。结果表明,系统中主要存在好氧呼吸菌群及厌氧发酵菌群两大类,优势菌群为以呼吸代谢为主的假单胞菌属、以发酵为主要代谢方式的拟杆菌/噬纤维菌菌属和纤毛菌属。同时好氧菌群中还发育有α蛋白菌、β蛋白菌、γ蛋白菌、硝化螺菌属、土壤杆菌属、衣原体属、葡萄糖杆菌属及褐色高温单孢菌属细菌;厌氧菌群中则发育属于螺旋体属、δ蛋白菌、反硝化菌、乳杆菌属;此外,使生物量的增长减少的各种慢速生长菌群也是本系统内的一大特色菌群。生物多样性的存在,是污泥减量化研究的关键。     

福建漳江口红树林沉积物中的古菌类群

利用环境16S rRNA基因序列分析技术,对福建漳江口红树林沉积物中存在的古菌类群进行检测。首先提取红树林沉积物的总DNA,并进一步构建环境16S rRNA基因克隆文库。随机挑选文库克隆,根据Amplified rDNA restriction analysis(ARDRA)分析分型后进行测序。对所测序列进行系统进化分析。结果显示,文库中的大部分古菌克隆(95%)分别属于广古菌门(Euryarchaeota)中的Marine benthic group D和泉古菌门(Crenarchaeota)的Miscellaneous crenarchaeotic group和Marine group I等3个已描述的古菌类群, 另有小部分克隆(5%)可能代表广古菌门中新的古菌类群。Miscellaneous crenarchaeotic group类群古菌是红树林沉积物中古菌的优势类群。上述古菌类群的检测加深了人们对于红树林古菌群落结构复杂性及其生态学意义的认识。     

太原地区健康成年人肠道菌群结构及其与BMI关系初探

以太原地区健康成年人为研究对象,根据BMI指数将其分为3组,采集粪便样本提取DNA,进行肠道菌群16S rDNA高通量测序、OUT聚类、物种注释以及生物信息分析,探讨健康成年人肠道菌群分布特点及其与BMI的关系。结果表明:太原地区健康成年人肠道菌群分12个菌门、139个菌属,在门水平上以厚壁菌门(Firmicutes)(占51.16%)、拟杆菌门(Bacteroidetes)(占33.29%)、变形菌门(Proteobacteria)(占10.95%)、放线菌门(Actinobacteria)(占2.49%)为主,占到微生物总量的98%;在属水平上以拟杆菌属(Bacteroides)(占20.65%)、栖粪杆菌属(Faecalibacterium)(占7.10%)、毛螺菌属(Lachnospira)(占5.52%)、普氏菌属(Prevotella)(占4.81%)、Lachnoclostridium(占3.93%)、Parasutterella(占3.86%)、[Eubacterium]rectale group(占2.95%)、杆菌属(Dialister)(占2.84%)、Subdoligranulum(占2.82%)、Phascolarctobacterium(占2.79%)为主,占微生物总量的57%;健康成人肠道菌群复杂多样,但主要菌群相对稳定,BMI与肠道菌群具有一定的相关性。     

厦门市区10月份大气气溶胶中细菌群落结构的初步研究

为了全面准确地研究厦门大气气溶胶的细菌群落构成,使用不依赖于培养的分子生态学手段对厦门市区10月份大气气溶胶中的细菌群落结构多样性进行了分析.通过气溶胶采样器在10月份3次收集了气溶胶样品,利用膜DNA提取试剂盒能够较有效地提取到气溶胶中的环境DNA,并且所提取的DNA能够用于后续的PCR扩增及细菌16S rRNA基因克隆文库的构建.克隆文库中的100个克隆子分别分布在3个细菌类群中,分别是:壁厚菌门(Firmicutes),β及γ变形细菌门(Proteobacteria).其中厚壁菌门的克隆子占71%,β变形细菌门占28%,γ变形细菌门占1%.细菌气溶胶的优势菌为Solibacillus属、微小杆菌属(Exiguobacterium)、罗尔斯顿菌属(Ralstonia).在所构建的克隆文库中,发现有部分的克隆子的序列与致病菌或机会致病菌的16S rRNA基因的序列相似,包括引起医院血液感染的细菌不动杆菌属(Acinetobacter)和皮氏罗尔斯顿菌(Ralstonia pickettii),坏疽性口炎及口腔溃疡病原菌(Caryophanon sp.)等.为长期全面监测厦门市微生物气溶胶的组成与变化以及评估空气中微生物对人类健康的潜在影响提供了重要信息.