水华蓝藻中微囊藻毒素的提取及其光催化降解

微囊藻毒素(MCs)广泛产生于水华蓝藻中.本研究从太湖水华蓝藻中提取出MCs,发现主要成分为MC-RR.经多级分离和半制备色谱提纯制备得到MC-RR纯品.用水热法合成了钨酸铋(Bi2WO6)催化剂,并对其进行了X射线衍射(XRD)、扫描电子显微镜(SEM)、比表面积(SBET)、等电点pH(pHZPC)等表征.利用不同pH条件下制备的Bi2WO6,在近紫外光照射下对MC-RR进行光催化降解,发现在酸性条件下制备的Bi2WO6有较强的降解效果.同时发现,Bi2WO6对MC-RR的降解以空穴直接氧化为主.     

微囊藻毒素-RR 对大肠杆菌和枯草杆菌的渗透效应

微囊藻毒素是一类由蓝藻产生的具有肝毒性的环状肽类化合物, 是富营养化淡水水体中最常见的一种藻类毒素, 也是蓝藻水华污染过程中产量最大、危害最严重的藻毒素种类. 本文研究了微囊藻毒素MC-RR 对大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草杆菌(Bacillus subtilis)细胞膜的渗透效应, 采用MC-RR 和溶菌酶协同处理下由于细胞溶解而引起吸光值A₆₇₅  的降低来表示. 结果表明, A₆₇₅ 值的降低随MC-RR 处理浓度和时间的变化而变化, 浓度越高, A₆₇₅ 值降低越明显, 由此表明, MC-RR 的存在增加了细菌细胞膜对溶菌酶的渗透性, 促进了溶菌酶的溶菌效应. 更进一步的实验证明, MC-RR 能促进细菌细胞内可溶性蛋白和可溶性糖的外渗量, 并且具有一定的剂量效应. 实验结果还进一步暗示, MC-RR 和水环境中的其他化合物的复合效应或许能够调节水体中的细菌群落, MC-RR 在水体生态系统中可能具有非常重要的生态学意义.     

HIV-1gp41不同片段表达对E. coli细胞毒性作用分析

HIV-gp41基因在E. coli中难以表达, 为研究影响其表达的原因, 选择gp41不同区域构建表达质粒, 通过在E. coli BL21(DE3)中进行表达测定其对细菌的毒性作用. 结果表明, IPTG诱导后除质粒pET-HN2表达菌以外其余质粒表达菌大量死亡, 目的基因转录的mRNA量也迅速下降, [³H]尿嘧啶释放实验显示释放增加, 说明GP41蛋白的毒性作用主要表现为对表达菌细胞膜的破坏而成为其在E. coli中难以表达的主要原因.     

Klebsiella oxytoca HP1 adhE基因插入失活法构建产氢重组菌

乙醇是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) HP1厌氧发酵产H₂的主要副产物, 每生成1.0 mol的乙醇需要消耗2.0 mol NAD(P)H, 从而降低了H₂的产量. 本研究以编码乙醇脱氢酶系(含乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶活性)的adhE基因为改造目标, 利用同源重组技术获得了以提高产氢为目标的K. oxytoca重组菌. 构建工作包括: 根据adhE基因保守序列框克隆K. oxytoca HP1 adhE基因片段, 以质粒pMHE6为模板进行链霉素抗性基因表达盒的扩增, 表达链霉素抗性的aadA基因片段和adhE基因片段分别与载体pMD18-T相连构建重组质粒, 同源整合质粒pTA-Str的构建, 以链霉素作为筛选标记筛选重组菌. 菌落PCR鉴定结果表明, aadA基因表达盒通过质粒pTA-Str的介导已定点插入K. oxytoca HP1基因组中, 成功地构建了adhE基因部分片段缺失的重组菌. 葡萄糖发酵实验结果表明, 相同发酵条件下, 重组菌比野生菌的产氢量提高了16.07%, 乙醇产量下降了70.47%. 利用基因工程技术提高产氢初步获得成功.     

含有碳纳米管复合材料的细胞亲和性

制备了一种聚-(L-乳酸)(PLLA)和碳纳米管(CNTs)的复合材料, 并利用原子力显微镜(AFM)和接触角检测对材料的表面形貌和性质进行了表征. 初步研究了复合材料的生物相容性以及CNTs对细胞亲和性的影响. 结果表明, 复合材料对于鼠3T3成纤维细胞和Oct-1成骨细胞具有良好的生物相容性. CNTs的加入对细胞亲和性有很大影响, 对细胞的贴附有一定的抑制作用.     

微囊藻毒素产生过程中氮素作用的同位素示踪研究

水华毒藻和藻毒素污染是目前水体富营养化治理与控制中的重要水质问题. 为了探索氮素对藻毒素产生过程的影响, 利用¹⁵N同位素示踪技术研究了无机氮在微囊藻毒素(Microcystins, MCs)生物合成过程中的作用. 纯种铜绿微囊藻室内同位素示踪培养实验和MCs分析结果发现, ¹⁵NO^-₃标记组可有1~3个¹⁵N原子引入LR型微囊藻毒素分子(Microcystin-LR, MCLR), 其中引入2个15N的概率最大; 15NH4+标记组可有2~4个¹⁵N原子引入MCLR分子, 引入3个¹⁵N的概率最大; 且来自NH4+态氮的15N比来自NO₃^-态氮的15N在MCLR分子中有更多的结合位点. 这说明, NH₄⁺态氮和NO₃^-态氮对MCLR的生物合成都具有重要的、直接的贡献, 但NH₄⁺态氮的存在更有利于微囊藻产生MCLR. 因此, 在富营养化水体藻毒素污染预防和富营养化控制中, 不能单独强调磷素的突出作用, 氮素控制特别是氨氮控制应引起足够重视.     

细菌Ⅱ型分泌途径控制产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes) S2中卵磷脂酶的分泌

从水稻根际分离筛选出1株降解卵磷脂的有机磷降解细菌菌株S2, 通过形态指标、生理生化性状、16S rDNA序列、(G+C)含量以及DNA-DNA杂交分析, 鉴定为产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes). 采用双亲接合的方法将带有Tn5转座子的质粒导入产碱假单胞菌S2菌株中进行转座子插入诱变, 从5000个卡那霉素抗性的Tn5插入突变株中, 筛选到3株丧失解磷能力的突变株(M808, M1329和M1400)和1株解磷能力增强的突变株(M20). 对Tn5插入位点的基因进行DNA测序表明, 丧失解磷能力突变株中被突变的基因分别是xcpS, xcpX和xcpW, 它们分别编码XcpS, XcpX和XcpW蛋白, 这些蛋白是细菌Ⅱ型分泌途径中的主要成分. 将xcpS, xcpX和xcpW基因分别构建在pLAFR3载体上, 通过双亲接合的方式分别导入上述M808, M1329和M1400三个丧失解磷能力突变株中进行功能互补实验, 结果表明这3个基因都能使各自相对应的突变株恢复解磷能力. 以上结果表明, 在产碱假单胞菌中卵磷脂酶的分泌是通过Ⅱ型分泌途径来完成的. 解磷能力的丧失可能是由于Tn5插入xcp基因簇中的某一基因破坏了卵磷脂酶向胞外的分泌, 造成突变株不能降解有机磷. 在解磷能力增强突变株M20中, 被突变的基因与铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) PAO1中的chpA基因(参与细菌的颤动)同源性达88%.     

固氮斯氏假单胞菌四碳二羧酸转移酶DctPQM的跨膜结构分析与功能研究

固氮斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501四碳二羧酸转移酶系由dctPQM基因编码. 基因序列和结构分析表明, dctP, dctQ和dctM紧密连锁, 并在核苷酸和氨基酸水平上与自生固氮菌棕色固氮菌的四碳二羧酸结合蛋白基因dctP和转运蛋白基因dctQM高度同源. 经分析表明, DctP不含跨膜区, DctQ包含5个跨膜区, DctM包含12个跨膜区. 为验证四碳二羧酸转运系统对固氮能力的增强作用, 将含有完整dctPQM基因的DNA片段连接在自杀性转移质粒载体pSZ21的Tn5转座区域中, 获得重组质粒pSZY6. 采用三亲接合方法, 经Tn5转座作用将dctPQM基因随机插入到野生型菌株A1501的染色体上, 构建了重组菌株A-142. 经nptⅡ基因的PCR扩增实验证明, 该重组菌株确实携带了额外拷贝的dct结构基因. 该重组菌株以不同浓度的琥珀酸、延胡索酸和苹果酸(20, 10和5 mmol/ L)为惟一碳源生长时, 其固氮活性均明显高于野生型菌株A1501, 表明额外拷贝的四碳二羧酸转移酶系编码基因dctPQM能增强受体菌的固氮能力.     

一种新的有机磷降解酶的分离纯化及酶学性质研究

从农药厂被污染的土壤中分离到一株降解有机磷农药的高效菌株C2-1, 经鉴定表明为假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes). 对其产生的有机磷降解酶OPHC2进行了分离和纯化, 并对其酶学性质进行了研究. 其降解甲基对硫磷的最适温度为65℃, 最适pH为9, 并且此酶具有很好的热稳定性和pH稳定性, 对大多数金属离子和化学试剂不敏感. OPHC2氨基酸序列及其编码基因的核苷酸序列分析表明, OPHC2与目前发表的有机磷降解酶没有同源性.     

病毒诱导的烟草DHS基因的沉默

将本生烟草(Nicotiana benthamiana) DHS (deoxyhypusine synthase, 脱氧羟腐胺赖氨酸合酶)基因的cDNA片段插入到马铃薯X组病毒(PVX)载体中, 构建重组病毒载体PVX-NbDHS. 通过病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)系统, 抑制本生烟草DHS基因表达. 感染植株表现为生长增强、叶片叶绿素含量下降、叶片衰老延缓和开花推迟. 半定量RT-PCR和Northern blot结果表明, PVX-NbDHS-VIGS植株中DHS mRNA丰度显著下降. Western blot检测表明, DHS靶蛋白eIF-5A的表达量与DHS呈平行下调变化. 综合分析植物表型和相应基因表达水平, 可以推断DHS在植物生长与发育中起重要作用.     

耐辐射球菌DNA修复开关基因pprI缺陷性突变和功能补偿性突变株的建立

PprI是近来在耐辐射球菌Deinococcus radiodurans中发现的一个极其重要的DNA修复开关基 因. 以已测序的野生型菌株R1为材料, 运用PCR突变法将克隆具有自身GroEL启动子和卡那霉素抗性基因的DNA片段反向重组到pprI基因中去, 首次获得了卡那霉素抗性的、pprI功能完全破坏的突变株YR1. 辐射细胞生存率结果表明, YR1对辐射异常敏感. 另外, 将含有GroEL启动子和卡那霉素抗性基因的DNA片段重组到质粒pRADZ3中, 获得了具有卡那霉素抗性的表达质粒pRADK; 再将体外克隆的具有pprI完整基因和C-末端结构域截短的PprI蛋白基因片段分别重组到pRADK中. 研究结果表明, 含有pprI完整基因的表达质粒在YR1中能够正常表达, 并完全恢复到野生型的极端抗性; 而C-末端结构域截短的PprI蛋白基因片段虽能在YR1中正常表达, 但对辐射异常敏感, 不能恢复其极端抗性. 上述pprI基因功能缺陷性和功能补偿性突变株的建立, 为深入研究细胞体内PprI蛋白质的定位、结构域与功能的关系, 以及原位研究PprI蛋白质的理化特性提供了十分有效的方法     

异源nifA基因对苜蓿中华根瘤菌nifA突变体的互补分析

为深入研究苜蓿中华根瘤菌NifA的特性, 分别用组成型表达的慢生型大豆根瘤菌和紫云英根瘤菌的nifA 基因互补苜蓿中华根瘤菌nifA 突变体, 观察其共生表型. 结果表明, 慢生型大豆根瘤菌和紫云英根瘤菌nifA 基因不能互补苜蓿中华根瘤菌nifA 突变体的共生表型. 以苜蓿中华根瘤菌 nifA 突变体为遗传背景, 利用全基因组微阵列实验比较分析引入异源nifA 基因后产生的基因表达谱的变化. 结果显示, 苜蓿中华根瘤菌自身NifA蛋白引起238个基因的表达发生变化. 这些表达差异的基因分属共生、能量和中心代谢、持家、细胞结构与运输等生物学功能组. 慢生型大豆根瘤菌、紫云英根瘤菌和阴沟肠杆菌的NifA蛋白分别引起了20, 7和9个基因的表达发生变化. 这些基因主要是固氮相关基因, 但差异不及苜蓿中华根瘤菌NifA互补菌明显. 以苜蓿中华根瘤菌nifH启动子与lacZ融合基因为报道基因, 研究nifH的表达. 结果指出, 慢生型大豆根瘤菌和紫云英根瘤菌的NifA蛋白只能部分激活苜蓿中华根瘤菌nifH的表达, 激活水平分别为苜蓿中华根瘤菌NifA蛋白激活率的70%和50%, 与微阵列实验结果相符.     

农杆菌介导法获得转pac1基因小麦并表现对大麦黄矮病毒的抗性

自裂殖酵母中克隆得到pac1基因, 与GenBank中相关的核苷酸序列有99.3%的相似性. 编码蛋白质序列分析表明, 其具有RNaseⅢ结构域和双链RNA结合结构域. 体外活性测定表明, 以pET-5a系统在大肠杆菌中表达的pac1产物能够降解dsRNA. 将pac1导入双元载体pBI121, 以培养7~10 d的小麦幼胚为受体材料, 利用农杆菌株LBA4404对小麦品种陇鉴127进行转化, 获得了41株G418抗性植株, 经点杂交(dot blot)、RT-PCR和nptⅡELISA检测证实, 其中25株整合有外源基因并能正常表达. 对这25株转基因小麦进行大麦黄矮病毒的抗性鉴定表明, 有12株表现低度抗性, 表现为低接毒量时无症状, 接毒量提高时发病且严重; 有12株表现中度抗性, 表现为低接毒量时无症状, 接毒量提高时局部有不严重症状; 有1株表现高度抗性, 两种情况下均无症状. 抗性实验结果表明了pac1介导的抗性具有剂量效应的特点.     

苜蓿根瘤菌1021外源cAMP上调glnⅡ及glnK-amtB的表达

苜蓿根瘤菌1021中多个腺苷酸环化酶基因的存在, 暗示着cAMP的重要性. 本研究用全基因组DNA微阵列分析了外源cAMP对苜蓿根瘤菌的功能. 分析结果表明, glnⅡ和glnK的转录水平在外源cAMP存在时有明显上调. 通过测定glnⅡ和glnK启动子与lacZYA报告基因融合系统在苜蓿根瘤菌体内的活性, 再次证实外源cAMP对glnⅡ和glnK启动子表达有激活作用.     

具有硒吸附能力乳酸菌的筛选及安全性评价

乳酸菌具有将无机硒转化为有机硒的潜在能力和多种益生特性,故将其作为安全高效的硒载体进行补硒已日益成为研究热点.本研究通过测定来源于8个种水平的43株乳杆菌的硒吸附能力,最终筛选出一株具有硒吸附能力较高的乳杆菌菌株植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)RS7-1,其对硒的吸附率可达40.79%.同时,通过测定不同初始p H、初始菌体浓度、初始硒浓度和不同吸附时间研究该菌株的吸附特性.此外,测定该菌株的耐酸和耐胆盐特性以研究其在胃肠道中是否仍可保持较高活性,并通过体外抗生素耐受性实验以及体内急性毒性实验和30d喂养实验对其安全性进行评价.结果表明,植物乳杆菌RS7-1硒吸附的最适p H为5.0,最适初始菌体浓度为2g/L,在初始硒浓度为20mg/L时达到最大吸附量,在吸附时间为60min即达到平衡.同时,该菌株具有较强的耐酸和耐胆盐能力,不存在非种属特有的抗生素耐受性.动物实验结果表明,饲喂植物乳杆菌RS7-1菌悬液的实验组小鼠的摄食量、体重、血常规指标和血生化指标与空白组无显著差异,且组织器官无病变.因此,综合评价植物乳杆菌RS7-1是一株硒吸附能力强、耐酸和耐胆盐、安全性好的乳酸菌,具有良好的应用价值.     

一种基于电化学发光技术的高灵敏度PS-1基因点突变检测方法

电化学发光(electrochemiluminescence, ECL)分析是20世纪90年代初发展起来的一种高灵敏度检测方法, 它将电化学法和化学发光法巧妙结合, 利用金属钌的复合物和三丙胺在电极表面发生氧化还原反应而产生高效、连续、稳定的发光, 具有灵敏、快速、准确、操作简便和分析适应性广等特点, 已被应用于核酸的定量分析之中. 将电化学发光技术应用于基因点突变检测, 采用了一种基于PCR技术和限制性内切酶技术的电化学发光分析方法检测Presenilin-1基因(简称PS-1基因)密码子235处发生的点突变. 结果显示, 在PCR循环次数相同的条件下, 野生型样品酶切前后的电化学发光信号强度基本保持不变; 突变型样品酶切前后的电化学发光信号强度变化显著. 该方法可明显区分野生型样品和突变型样品, 可望用于老年性痴呆病的早期诊断.     

磁性碳纳米管吸附/微波再生处理水中五氯苯酚

利用热分解法制备了磁性碳纳米管,采用扫描电子显微镜(SEM)、X射线衍射分析仪(XRD)、比表面积分析仪(BET)进行了表征.研究表明,磁性碳纳米管纯度高且孔隙均匀,外径约为50 nm,比表面积为146.7 m2/g;同时加外磁场可以快速其分离.磁性碳纳米管应用于吸附/微波再生处理水中五氯苯酚,结果表明,磁性碳纳米管对五氯苯酚的吸附动力学符合Langergren模型,其平衡吸附量为30.5 mg/g;吸附等温线符合Freundlich模型.吸附饱和磁性碳纳米管经微波再生循环使用5次,再生率均高于100%,且磁性良好.     

水稻散生突变体的遗传和基因定位研究

分蘖角度是构成水稻理想株型和高产育种的重要农艺性状之一. 通过对水稻散生突变体的遗传学分析认为, 该散生表型受一隐性核基因控制, 与已报道的水稻散生突变体la等位, 故将此突变体命名为la-2, 而原突变体被重新命名为la-1. 利用la-2与w11和浙福802分别杂交产生的F₂群体对LA位点进行遗传定位, 发现其与第11号染色体上的微卫星标记RM202和RM229连锁, 遗传距离分别为10.0和8.0 cM. 通过进一步在两标记间发展的6个新的分子标记, 将该基因精确地定位于约0.4 cM的区间. 为进一步克隆LA基因和探讨水稻分蘖角度的控制机制奠定了良好的基础.     

L-苯丙氨酸在单壁碳纳米管上的吸附行为

采用一种简单、绿色的过程获得了稳定的单壁碳纳米管/L-苯丙氨酸溶液. 除纯化及氧化过程, 单壁碳纳米管未进一步功能化. 结合多种物理化学表征方法对L-苯丙氨酸在单壁碳纳米管上的吸附机理进行了研究. 氧化后的单壁碳纳米管对苯丙氨酸的吸附量为33%(质量分数), 单壁碳纳米管对吸附于其上的苯丙氨酸的热分解具有催化作用. 对不同直径的单壁碳纳米管, 苯丙氨酸具有吸附选择性, 优先吸附于直径较小的单壁碳纳米管. 在π-π相互作用、H键和部分共价键的共同作用下, 苯丙氨酸被吸附在单壁碳纳米管上.     

红树植物耐盐基因转化烟草及耐盐品系的培育

从耐盐性强的红树植物白骨壤(Avicennia marina)中分离出的耐盐基因CSRG1, 构建了pGAM189/CSRG1转基因载体. 以烟草嫩叶为外植体, 通过农杆菌介导的叶盘转化法将CSRG1基因及GUS基因, Km^r基因和Hyg^r基因转入烟草基因组中. 转化50个外植体, 经过50 mg/L潮霉素和150 mg/L卡那霉素抗性筛选共获得了13个稳定抗性株系. 通过PCR扩增检测、Southern blot分析和GUS基因活性检测, 结果表明, 最终获得的11个转基因品系(基因转化频率为22%)中, CSRG1基因整合到烟草的染色体DNA上. Northern blot分析结果表明, CSRG1基因在转基因植株中获得表达. 耐盐性测定和光合速率测定结果表明, 转基因植株在盐分提高到2% NaCl和全海水(盐度为24)配置的MS培养基中, 成活率保持在80%~90%, 株高增长20%~40%, CSRG1基因的表达产物及形成的生理代谢途径确实可使烟草获得较高的耐盐性, 同时这种耐盐性不仅针对钠离子胁迫, 而且对于各种离子的综合盐胁迫都具有耐受性.