苏云金杆菌4.0718菌株的发酵上清液中超氧化物歧化酶研究

将苏云金杆菌4.0718进行液体发酵培养，从发酵上清液中可以抽提得到SOD。经（NH4）2SO4分级沉淀、Sephadex G-75凝胶过滤和HPLC3步纯化得到均五性SOD，其比活力达1040U/mg。经检测该酶属Fe-SOD，分子量为39486D，由2个相同亚基组成，其N-末端氨基酸为丙氨酸，讨论了发酵上清液中SOD与晶体蛋白杀虫毒力的关系。     

苏云金芽胞杆菌高效电转化方法的建立

电转化已经成为苏云金芽胞杆菌工程菌构建过程中非常重要的一种外源基因导入方法.高效率的电转化方法将加速这类研究进展.通过对培养基、培养时间、感受态细胞制备、电转化缓冲液、电压参数的优化,建立一种高效的苏云金杆菌电转化方法.苏云金杆菌生长在含有0.5 mol/L山梨醇的BHI培养基中,30℃振荡培养至OD600值达到0.6～0.8,细菌细胞经1 g/L蛋白酶K在37℃处理20 min,然后用电转化缓冲液洗涤2遍,设定电压为1 800 V,电击1次.利用该方法,pHT315质粒在苏云金杆菌中的转化效率大幅提高.     

响应面法优化苏云金芽胞杆菌YC-10发酵培养基

为获得杀线虫Bt菌株YC-10最佳培养基配方,以发酵液中伴胞晶体蛋白浓度为评价指标,利用Plackett-Burman实验设计和响应面分析法对YC-10的培养基配方进行室内摇瓶优化筛选.实验结果表明:大豆饼、玉米粉、氯化钙和磷酸氢二钾为4个显著影响因子,YC-10最优培养基配方为:黄豆饼25.73 g/L,玉米粉12.57g/L,CaCl_20.25 g/L,K_2HPO_40.43 g/L,ZnSO_40.20 g/L,MgSO_40.20 g/L,MnSO_40.25 g/L,FeSO_40.25 g/L.     

苏云金芽胞杆菌cry7Ab9基因的克隆与杀虫活性的测定

以辽宁省千山市的22株苏云金芽胞杆菌进行PCR cry型的cry7类基因鉴定,对cry7类基因进行克隆表达及生物活性测定,为cry基因储备奠定基础.菌株QZG121经比对后发现含有cry7Ab基因.克隆该基因全长序列为3 417 bp,编码1 138个氨基酸残基,相对分子质量为130 000,并在Gene Bank中登记,基因登录号为GU936713,由苏云金芽胞杆菌国际命名委员会正式命名为cry7Ab9.通过构建原核表达系统获得cry7Ab9基因表达蛋白,并进行暗黑鳃金龟幼虫杀虫活性的测定,7天校正死亡率10 mg.L-1为11.11%、100 mg.L-1为25.93%;两周校正死亡率10 mg.L-1为33.33%、100 mg.L-1为48.15%,LC50为289.99 mg.L-1.     

苏云金杆菌S88菌株对小菜蛾的防效

利用苏云金杆菌HD-1经γ辐射诱变筛选的菌株S88发酵制剂防治萝卜上的小菜蛾,效果明显,4d防效达88.09%,6d防效达91.73%,且对环境中的瓢虫、蜘蛛等害虫天敌伤害很小,1000倍BtS88制剂可以完全用来代替化学农药用于防治蔬菜小菜蛾等害虫,有实际意义。     

枯草芽胞杆菌ACCC-10619产芽胞条件的研究

通过单因素发酵试验和正交试验,确定了枯草芽胞杆菌ACCC-10619最佳培养基配方和发酵条件.结果表明最佳质量分数组合为:麸皮3.0%,葡萄糖3.0%,硫酸铵0.5%,硫酸锰0.05%,发酵温度33℃,初始pH为7.0,发酵周期36 h,静置时间12 h.经100 L发酵罐液体扩大培养,芽胞产量达8.5×1013个/L.为枯草芽胞杆菌微生态制剂生产应用提供参考.     

喂食Cry1Ac毒素对棉铃虫中肠类胰蛋白酶的影响

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)在芽胞形成过程中产生的原毒素被敏感昆虫吞食进入消化道后,在中肠蛋白酶的作用下经历一系列酶的剪切活化过程,形成具有杀虫活性的毒性肽.类胰蛋白酶因其在昆虫中肠内蛋白质水解和Bt毒素活化中起着重要作用而受到广泛研究.本研究提取了棉铃虫4龄幼虫的中肠BBMV蛋白,利用SDS-PAGE分析鉴定到喂食Cry1Ac毒素24 h后,棉铃虫幼虫中肠类胰蛋白酶的表达量呈明显下降趋势.该下降趋势很有可能是作为一种昆虫对Bt毒素作用的早期反应,通过影响Bt毒素在中肠中的酶解活化过程,从而为昆虫提供即时保护.     

苏云金芽孢杆菌伴孢晶体中20-kb DNAs上染色体基因的鉴定

已有的研究表明苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)4.0718菌株菱形晶体中含有与原毒素紧密结合的20-kb DNAs,利用PCR-RFLP分析发现在这些20-kb DNAs上含有cry1Aa、cry1Ac、cry2Aa和cry2Ab基因.本研究利用特异引物从4.0718菌株中20-kb DNAs上分别扩增出带有自身调控序列的cry1Ac和cry2Aa基因,并将其分别电转至Bt无晶体菌株Cry-B中获得重组菌株Cry-B(pHC42)和Cry-B(pHC39).SDS-PAGE和透射电镜分析表明这两种重组菌株能够分别产生由130-kDa的Cry1Ac原毒素形成的菱形晶体以及由65-kDa的Cry2Aa原毒素形成的方形晶体.毒力生测的结果显示,这两种菌株的表达产物对棉铃虫(Helicoverpa armigera)幼虫具有预期的杀虫效果.重组菌株分别形成的两种晶体经不同的缓冲液溶解后能释放出与20-kb DNAs紧密结合的原毒素,同时在20-kb DNAs上均可检测到源于Bt染色体的spo0A和nprA基因片段.     

苏云金芽孢杆菌伴胞晶体蛋白提取方法比较研究

采用液体双相分层法和等电点沉淀法提取苏云金芽孢杆菌伴胞晶体蛋白.原子力显微镜观测,发现液体双相分层提取的晶体蛋白具有完整典型的晶体结构;等电点法提取的得率高,不能检测到完整的晶体结构.聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,等电点法提取的蛋白质含量是液体双相法提取的蛋白含量的1~2倍.将2种方法提取的晶体蛋白对初孵棉铃虫幼虫生物测定均表现杀虫生物活性,经统计分析,液体双相法提取的蛋白质生测毒力比等电点法的高1.5~3倍.     

一株枯草芽胞杆菌的分离鉴定及其杀虫活性的研究

以从土壤中自行分离的219株芽胞杆菌中筛选的一株枯草芽胞杆菌菌株HX08为研究对象,通过菌落形态观察、扫描电镜、激光共聚焦显微镜等进行菌体形态观察以及16S rRNA基因同源性分析等一系列方法鉴定,该株细菌属枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis,命名为HX08,并将其16S rRNA基因序列提交上Genebank数据库,获得登陆号KF774302.通过生测发现,HX08菌株在60 h发酵时间段对棉铃虫的致死效果最好.对该菌株发酵液提取的活性蛋白进行初步研究,建立了HPLC技术分离体系,使用H2O做流动相,以0.5 mL/min流速洗脱,检测波长分别为215、254和280 nm,收集第15 mL收集管处即保留时间为31 min的2号峰粗分离物活性较高.切取SDS-PAGE胶上相对应活性峰目的蛋白质条带酶解,利用质谱(LTQ-MS)技术进行了分子特性分析,鉴定发现杀虫活性蛋白成分为草酸脱羧酶.     

基于应变模态的桁架结构损伤识别

选用桁架结构作为研究对象,对一简支桁架建立仿真模型,通过单元刚度的减小模拟损伤变化,用节点位移转变为单元应变的方法,对桁架结构进行损伤识别.经过试验研究,验证了一阶相对应变模态对结构损伤识别的有效性.     

高产超氧化物歧化酶芽孢杆菌C328菌株产酶培养基的研究

研究了芽孢杆菌(Bacillus cereus)C328 SOD(Superoxide dismutase)生产菌株在发酵培养过程中培养基种类、碳氮比以及补充碳氮源对产酶的影响．结果表明，C328菌株发酵产酶率与培养基种类、复配碳氮比有密切关系,培养基浓度为10％时，对菌株生长及产酶有明显的促进作用，超过13％则抑制SOD酶产生．筛选出最佳产酶发酵农副产品培养基和优化配比组合产酶培养基。     

高产超氧化物歧化梅芽孢杆菌C328菌株产酶培养基的研究

研究了芽孢杆菌(Bacillus cereus)C328 SOD(Superoxide dismutase)生产菌株在发酵培养过程中培养基种类、碳氮比以及补充碳氮源对产酶的影响.结果表明,C328菌株发酵产酶率与培养基种类、复配碳氮比有密切关系.培养基浓度为10%时,对菌株生长及产酶有明显的促进作用,超过13%则抑制SOD酶产生.筛选出最佳产酶发酵农副产品培养基和优化配比组合产酶培养基.     

嗜热硫氧化硫化杆菌一新菌株的分离与鉴定

从云南腾冲酸性热泉富集物中分离到一株适度嗜热喜酸菌YN22.该菌革兰氏染色阳性,直杆状或微弯,长约1.6~2.8μm,直径0.4~0.7μm.该菌能在25~60℃下生长,最适生长温度为53℃;生长pH为1.0~5.0,最适pH为1.5;化能自养型,0.025%(w/V)的酵母提取物对其生长有明显的促进作用,在酵母提取物存在的情况下能快速氧化Fe2 ,但对S0和还原型硫化物的氧化能力较低.16s rDNA系统发育分析表明,该菌与嗜热硫氧化硫化杆菌(Sulfobacillus thermosulfidooxidans)的16s rDNA序列相似性达99%.YN22基因组DNA的G C含量为47.3 mol%,与嗜热硫氧化硫化杆菌模式菌株VKM B-1 269非常接近,后者基因组DNA的G C含量为47.5 mol%.基于形态特征、生理生化特性、系统发育学和G C含量的分析结果,YN22应归于硫化杆菌属(Sulfobacillus),为嗜热硫氧化硫化杆菌(Sb.thermosulfidooxidans)的一新菌株.这是国内首次分离,并经多种方法鉴定、确认的嗜热硫氧化硫化杆菌,从而为我国浸矿微生物的基础和应用研究提供了最典型的适度嗜热菌种.     

戊型肝炎病毒ORF2片段在毕赤酵母中的分泌表达及活性鉴定

为了寻求新型表达系统来研制戊型肝炎病毒基因工程疫苗，利用Pichia pastoris表达系统表达戊型肝炎病毒(HEV)结构区ORF2基因．利用PCR扩增HEV ORF2基因，然后将ORF2基因按正确的阅读框融合到Pichia postoris分泌型表达载体pPIC9K的a-因子信号肽编码序列3’端，重组表达载体在电击转化毕赤酵母，经过含G418的营养缺陷型培养基(RDB)筛选、重组酵母基因组总DNA进行PCR鉴定后，证实HEV ORF2基因已经整合到酵母基因组中并得到重组转化子．表型鉴定后对G418具有不抗性的重组菌株诱导表达，用双抗体夹心法ELISA筛选了表达外源蛋白的重组菌株，再经SDS-PAGE与Western blot证实ORF2基因在Pichia pastoris中实现了分泌表达，而且重组蛋白具有较强的特异性与生物学活性；同时用双抗体夹心法证实在Pichia pastoris表达的上清中存在衣壳蛋白聚体．     

高效絮凝剂产生菌的筛选、鉴定及培养条件优化

从实验室好氧活性污泥中分离出1株高效解凝刑产生菌株，鉴定为新月弯孢霉，命名为M—26。旨次发现了新月弯孢霉可产生微生物解凝剂。通过设计正交实验找出其影响因素的重要性顺序及较佳的培养条件。实验结果表明，该菌株在高氏培养基，初始pH值为7．0，转速为200r/min和水浴温度为35℃的条件下能产生高效解凝剂，对高岭土悬浊液的解凝率达到97％以上。