福氏志贺菌ipaB基因的克隆及序列测定

目的:克隆福氏志贺菌(Shigella flexneri,S.flexne)的ipaB基因。方法:以福氏志贺菌2a 2457T(Nal)r为模板,用PCR扩增ipaB目的基因片段,克隆至pQE-30表达载体中,构建含目的基因的表达质粒pQE-ipaB。结果:构建了重组质粒pQE-ipaB,ipaB基因全长1 743 bp,经测序分析与预期相符。结论:成功克隆了ipaB基因。     

简化的人纤溶酶原饼环区5基因的克隆及其在大肠杆菌中的融合表达

从正常人肝脏组织中提取总RNA,合理设计引物,利用RT-PCR直接得到简化的hPK-5基因.将该基因克隆至原核表达质粒pGEX-1λT,将此重组载体转化大肠杆菌JM109,经PCR、酶切及测序鉴定阳性克隆.用IPTG诱导阳性克隆表达融和蛋白,SDS-PAGE观察表达产物.再通过Western-Blotting鉴定.简化的hPK-5基因的RT-PCR产物为264bp.通过酶切、测序等方法鉴定简化的hPK-5基因正确克隆至原核表达质粒pGEX-1λT中.重组质粒pGEX-1λT/predhPK-5在大肠杆菌中     

带有TAT-PTD跨膜转导域融合基因的原核表达及表达条件优化

为构建pGEX-TAT-GFP原核表达质粒并优化GST-TAT-GFP表达条件,将PCR扩增的基因TAT-GFP克隆至质粒pGEX-2T,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达并优化表达条件,表达产物进行SDS-PAGE、Western blot及荧光学特性鉴定.结果表明:构建的质粒经PCR、酶切和DNA测序正确,含有重组质粒的宿主菌经过IPTG诱导表达分子量约为54.3 kD的融合蛋白GST-TAT-GFP,并经优化确定最佳的诱导表达条件.     

结核分枝杆菌Ag85B基因克隆及真核表达质粒pIRES-Ag85B的构建

目的:克隆并构建编码结核分枝杆菌Ag85B分泌蛋白的重组真核表达质粒,为进一步研究其在开发新型的结核病疫苗和结核病免疫诊断试剂奠定了基础。方法:采聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Ag85B基因,然后用双内切酶消化PCR产物和pIRES质粒,用T4 DNA连接酶连接后,转化入感受态E.coli DH5a,产物铺AmpR抗性的平板,阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定并进入blast网页比对测序的序列。结果:酶切鉴定所切下的片段大小与预计相符,测序比对后结果与目的基因完全一致,证实符合表达框架。结论:成功地克隆并构建Ag85B基因的真核重组表达质粒pIRES-Ag85B。     

Sry基因的克隆及其在HeLa细胞中的表达

目的:构建真核表达重组质粒pCR3.1-Sry.并检验其在真核细胞内的表达.方法:用PCR法从小鼠基因组中扩增出Sty全长基因,重组入pMD18-T载体,酶切鉴定重组质粒,对酶切正确的重组质粒测序.双酶切测序验证的重组质粒.将切下的片段与真核表达质粒pCR3.1相连构建pCR3.1-Sty重组质粒.将其转染HeLa细胞后,RT-PCR法检测重组质粒在细胞中mRNA的转录;免疫荧光法检测重组质粒在细胞中蛋白质的表达.结果:PCR法扩增得到了1.2 kb的特异性Sry基因片段;成功地构建了真核表达重组质粒pCR3.1-Sry;重组质粒pCR3.1-Sry在HeLa细胞中mRNA及蛋白水平均可检测到表达.结论:重组质粒构建成功并可以在体外真核细胞中表达,为进一步研究其作为核酸疫茁的免疫作用提供了可控的实验材料.     

重组质粒βhCG-pPIC9K的构建及嗜甲醇酵母(Pichia pastoris)的转化

目的 :为用基因重组技术表达hCG避孕疫苗抗原 ,构建在酵母细胞中表达的重组质粒βhCG -pPIC9K ,转化嗜甲醇酵母 .方法 :根据βhCG的cDNA序列设计两条引物 ,使上游带EcoRI酶切位点 ,下游带NotI酶切位点 ,以质粒 βhCG -PBSKS为模板 ,进行PCR扩增反应 ;将所得的DNA片段经EcoRI和NotI双酶切后用T4连接酶与pPIC9K质粒进行连接 ,然后导入大肠杆菌DH5α ,用PCR筛选阳性克隆并用双酶切鉴定重组子βhCG -pPIC9K .再用电打孔法转化酵母 (Pichiapastoris) ,用缺组氨酸MD平板筛选阳性株并在含G4 18的YPD培养基中筛选多拷贝插入菌株 .结果 :用所设计的引物扩增出两端分别带EcoRI和NotI酶切位点的βhCGDNA片段 ,插入pPIC9K并导入DH5α获得阳性克隆 ,经PCR反应和双酶切鉴定表明重组质粒是 βhCG -pPIC9K ,并转化嗜甲醇酵母获得耐受 4mg/mLG4 18的菌株 .结论 :构建了重组质粒 βhCG -pPIC9K并获得插入重组质粒 βhCG -pPIC9K的嗜甲醇酵母     

基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建PD-L1-GFP报告基因HT29细胞株

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和同源重组技术在PD-L1基因的特定位置敲入绿色荧光蛋白(GFP)序列,构建含有PD-L1-GFP报告基因的结肠癌细胞(HT29)稳定细胞株。根据CRISPR-Cas9靶点设计原则,针对PD-L1基因终止密码子设计两对sgRNA,退火形成双链后连接至Lenti-V2空载质粒中,转化培养后提取质粒并测序验证。对于正确的Lenti-V2-sgRNA重组质粒,T7E1酶切验证其基因编辑效率。根据靶点位置设计左同源臂+GFP+右同源臂序列合成Donor片段,双酶切后连接至pUC19,重组载体转化扩增后同样进行质粒提取和测序验证。将验证成功的Lenti-V2-sgRNA和pUC19-donor-GFP共转染HT29细胞,荧光显微镜检测GFP表达情况,菌落PCR及基因测序验证GFP报告基因的靶向插入效果。经酶切和测序鉴定,靶向编辑PD-L1的Cas9载体Lenti-V2-gRNA和含GFP基因的Donor质粒pUC19-donor-GFP构建成功。两个重组质粒转染HT29细胞后,显微观察、多克隆验证、单克隆筛选及鉴定结果显示,GFP成功转入HT29细胞并进行了...     

日本血吸虫卵壳蛋白编码基因的扩增及克隆

目的:扩增和克隆日本血吸虫卵壳蛋白编码基因(SjESG),以研究其作为候选疫苗分子和药物靶点的可能性.方法:合成引物,以日本血吸虫雌、雄虫cDNA第一链为模板,RT-PCR扩增日本血吸虫卵壳蛋白编码基因,与带有硫氧还蛋白(Trx)基因的高效原核表达质粒pET32a(+)定向重组,构建原核表达重组质粒,并经限制性核酸内切酶酶切分析和PCR鉴定.结果:从雌虫cDNA中扩增出624bp SjESG基因,原核表达重组质粒pET32a(+)-SiESG经限制性核酸内切酶酶切和PCR均获得624bp的DNA片段.结论:成功构建原核表达重组质#ipET32a(+)-SjESG.     

新基因hSSB1逆转录病毒载体的构建、鉴定和稳定株的筛选

 hSSB1 (Human Single strand DNA binding protein) 是参与细胞DNA损伤应答的一个重要信号分子。根据GenBank 提供的hSSB1基因序列扩增其cDNA序列,插入到pBABE逆转录病毒载体中, 连接后的质粒转化后经过双酶切,PCR扩增及测序来鉴定pBABE-hSSB1阳性克隆。将阳性表达的pBABE-hSSB1和包装质粒转染到HEK293T细胞中,产生病毒液。将包装好的病毒感染细胞并用嘌呤霉素(puromycin)筛选稳定表达hSSB1的细胞株。重组pBABE-hSSB1质粒经双酶切,PCR扩增鉴定及DNA测序分析等方法证实克隆成功。Western blotting检测发现转染重组质粒pBABE-hSSB1的细胞株中hSSB1蛋白的表达水平高于对照组。该研究成功构建了针对hSSB1基因的逆转录病毒载体(pBABE-hSSB1),并得到了稳定高表达hSSB1的细胞株, 为深入研究其功能奠定了基础。     

PML-RARα和hGM-CSF双基因表达载体的构建

目的:构建急性早幼粒细胞白血病(APL)PML-RARα基因与人粒巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因真核双表达载体,为利用DNA疫苗治疗APL奠定基础。方法:利用RT-PCR技术从NB4细胞的RNA中扩增出PML-RARα融合点附近的部分基因片段,通过PCR从pORF-hGM-CSF质粒中扩增出hGM-CSF基因,并分别将两基因片段连接到pIRES质粒的多克隆位点(MCS)A和B中,构建真核双表达载体。利用酶切和序列分析方法验证所构建载体的正确性。结果:NheI/M luI和XbaI/SalI双酶切证明重组质粒中含有相应大小的PML-RARα基因片段及hGM-CSF基因,且序列分析证明重组质粒中插入片段的碱基序列均完全正确。结论:成功构建了含有PML-RARα基因及hGM-CSF基因的真核双表达载体。     

c-Jun氨基末端激酶3结构域突变质粒的构建、鉴定与转染

为构建c-Jun氨基末端激酶3 (c-Jun N-terminal kinase3,JNK3)的p VP16-eGFP-Myc-JNK3活化环(activation-loop,A-loop)结构域突变型重组质粒,通过A-loop突变型JNK3的c DNA序列以及p VP16-eGFP-Myc的酶切位点设计引物,PCR扩增目的基因,使用限制性内切酶Mlu I与Xba I将基因克隆到p VP16-eGFP-Myc真核表达载体中,构建p VP16-eGFP-Myc-JNK3(A-loop)结构域突变型重组质粒。转化后,通过双酶切鉴定与DNA测序判断是否成功构建重组质粒,使用Trans IntroTMEL Transfection Reagent转染人胚肾(human emborynic kidney,HEK) 293T细胞,通过荧光显微镜下观察融合蛋白表达情况。结果表明:构建p VP16-eGFP-Myc-JNK3 (A-loop)结构域突变型重组质粒,双酶切鉴定和测序结果显示构建成功; p VP16-eGFP-MycJNK3 (A-loop)成功转染HEK293T细胞且表达。鼠源JNK3结构域突变型质粒构建成功,对进一步研究JNK3结构域在相关疾病的作用和机制提供实验工具。     

抗汉滩病毒单抗3G1 scFv植物表达载体的构建

利用PCR方法，从含有3G1 scFv基因的重组质粒中扩增出抗体基因，并使基因两端携带合适的限制性酶切位点．将其克隆人植物表达载体pBI121，构建获得3G1 scFv-pBI121重组质粒．酶切鉴定及测序结果均证明重组质粒构建成功，将重组植物表达载体转入农杆菌LBA4404，为进一步构建转基因植物的研究奠定了基础．     

人TCTP基因的克隆与原核表达

人翻译控制肿瘤蛋白（hTCTP）是一个在进化过程中高度保守且具有很高表达量的蛋白家族。本实验通过PCR技术扩增人hTCTP基因,经酶切后插入表达质粒pGEX-4T-2构建表达载体,转化大肠杆菌后挑选阳性菌进行菌落PCR及质粒酶切鉴定,确证克隆成功并构建了人hTCTP基因表达载体。重组表达载体经IPTG诱导表达出目的蛋白,用超声破碎、亲和层析和SDS-PAGE对目的蛋白进行了分离纯化并鉴定。     

A组乙型溶血性链球菌DNaseB基因亚克隆及pET-28a(+)-DNaseB载体构建

运用PCR扩增技术,以质粒pMD18-T-DNaseB为模板,扩增出0.5 kb截短的DNaseB基因,先将该基因片段与pMD19-T载体连接,确定该序列正确并进行大量繁殖后,再将DNaseB基因定向克隆入pET-28a( )表达载体中,构建新的原核表达载体pET-28a( )-DNaseB,转化该重组质粒至受体菌E.coliDH5a中,采用SDS碱裂解法提取该质粒DNA,经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定和核苷酸序列分析,证实插入的基因片段具有正确的DNaseB基因核苷酸序列,将pET-28a( )-DNaseB转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经过IPTG诱导其目的蛋白得到了表达.     

人类胰岛素基因的克隆及其真核表达载体的构建

从胎儿胰腺细胞中提取出总RNA作为模板,用特异性引物和RT-PCR法扩增INS基因的cDNA,PCR产物T-A克隆到T载体构建中间重组体pUC57-INS,其测序结果和Genbank公布的序列一致。HindIII和BamHI双酶切pUC57-INS后,将INS基因亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,经PCR扩增、酶切分析和序列测定后证实了重组表达质粒pEGFP-N1-INS构建成功。这将为转人类胰岛素基因动物模型的建立及人类糖尿病的基因治疗奠定必要的基础。     

粉尘螨Der f15的基因克隆与其表达载体的构建

先挑取纯培养的粉尘螨,提取总的RNA,后采用RT-PCR方法进行反转录出cDNA.由cDNA提取出目的基因进行片段扩增,产物连接入T载体(pMD18-T).经扩增后,用EcoR I和Xho I双酶切,将目的基因分别连接到pET28和pET32的表达载体上,得到重组质粒pET28和pET32,即粉尘螨的基因克隆与 表达载体构建成功.     

水稻磷酸酯酶2A基因蛋白的原核表达载体构建、表达和纯化

利用PCR技术,从水稻品种日本晴幼穗cDNA中扩增磷酸酯酶2A的基因ORF片段,并将其克隆入原核表达载体pGEX-6p-1中构建重组质粒pGEX-6p-1-PP-2A,经限制性内切酶酶切鉴定以及测序结果表明成功构建了原核表达载体pGEX-6p-1-PP2A。转化E.coli JM109并通过终浓度为0．4mmol／L的IPTG诱导,表达出39kD的CST-PP2A融合蛋白,并用蛋白亲和层析柱GSTrap FF对表达产物进行纯化,为下一步的研究打下了实验基础。     

纳豆激酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

构建pPICZαA-NK重组质粒，并转化入E.coli TOP-10中，得到转纳豆激酶基因工程菌，提取重组质粒经单酶切，双酶切，PCR分析及序列测定，证明克隆到载体pPICZαA上的外源基因即为纳豆激酶基因，将重组质粒pPICZαA-NK线性化后，分别转化毕赤酵母GS115与KM71，在含Zeocin^TM的选择性YEPD平板筛选到重组酵母，经检测重组酵母发酵上清液中具纳豆激酶溶纤活性，SDS-PAGE电泳结果表明外源蛋白的表达量占菌体蛋白的10%左右。     

外源乳酸脱氢酶基因在双歧杆菌中的表达

以大肠杆菌 双叉双歧杆菌的穿梭质粒pHJ为基础,插入从Lactococcuslactis总DNA中用PCR方法扩增得到的报告基因乳酸脱氢酶基因(ldh),构建了双叉双歧杆菌的表达质粒pHJ LDH,并采用电转化法导入双叉双歧杆菌进行了表达研究.对双叉双歧杆菌总蛋白的SDS PAGE分析结果表明,ldh报告基因的表达产物形成了明显的条带,Western blotting结果确认了该条带为ldh基因的产物.LDH的酶活性定量测定结果表明,重组双叉双歧杆菌的蛋白粗抽提液中LDH的比活性为5.5U/mg,菌中LDH的表达量约为2mg/L.此工作为今后双叉双歧杆菌的基因工程奠定了基础.