蛋白磷酸酶2C(PP2C)的表达、纯化与催化活性

从小鼠肌肉组织中提取了总RNA,经RT-PCR,扩增出蛋白磷酸酶2C(PP2C)基因,并构建了pUCm-T载体.经核酸序列分析证明PP2C基因序列正确后,将pUCm-T中的PP2C基因插入pET28a载体中,构建了表达载体pET28a-PP2C,并转化到E.coli BL21(DE3)进行表达.经测定,该菌株表达目的蛋白PP2C的最适条件为:诱导物IPTG的终浓度为0.8 mmol/L,37 ℃,诱导时间为20 h.在此条件下,PP2C实现了高效表达,表达的PP2C蛋白约占菌体总蛋白的18.2%,其中在裂解上清液、沉淀中分别占总蛋白的7.1%和11.1%.经SDS-PAGE分析,表达产物分子量约为42 000.应用Ni-NTA柱实现了可溶性PP2C的纯化,收率达80.5%,纯化的PP2C比活力达34.5 U/mg.     

人Sox2基因的克隆表达和纯化

应用RT-PCR方法从人胚胎十细胞中扩增出Sox2基因,构建pET28b-Sox2表达载体.用IPTG诱导转化pET28b-Sox2表达载体的大肠杆菌BL21(DE3).并优化表达条件为37℃ 1PTG0.8 mmol/L诱导4 h.以Ni-NTA亲和层析法纯化Sox2重组蛋白,对变性蛋白进行柱上和透析复性,复性后蛋白得率为0.7 mg/g湿菌重.     

PP2A B56α调节亚基原核表达载体的构建及表达

为了构建PP2A B56α调节亚基原核表达载体,以p CEP-4HA-B56α质粒为模板,设计引物克隆人源PP2A B56αc DNA,连入p GEX-4T-1载体中,测序正确后,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,并将诱导表达重组蛋白的菌体超声破碎后,进行可溶性分析,对可溶性蛋白进行纯化.SDS-PAGE电泳及Western Blot分析鉴定重组蛋白.结果表明,经测序和酶切鉴定后成功构建重组质粒p GEX-4T-1-B56α,表达大小约79 k D的重组蛋白,可溶性表达的重组蛋白为菌体总蛋白质量的8.6%,经GST纯化系统纯化得到纯度约为78.9%的重组蛋白,回收率达到52.2%.因此,本研究成功构建了PP2A B56α原核表达体系,获得重组蛋白,为研究PP2A B56α的生物学功能奠定了基础.     

人CDK4基因的原核表达及重组蛋白的纯化和复性

将人CDK4基因克隆入原核表达载体pET28a（+）中, 经 酶切和测序鉴定正确的重组质粒pET28a-CDK4, 转化E.coliBL21(DE3)后获得表达菌株. 该表达菌株经IPTG诱导后, 高效表达出带有组氨酸标签的以包涵体形式存在的融合蛋白, 表达量占菌体总蛋白的52.6%, 包涵体经过洗涤、 尿素变性溶解、 His Trap HP Kit柱纯化、 稀释复性, 获得纯度达98%以上的蛋白. SDS-PAGE及Western blot分析表明, 在分子量34 000处有一特异性蛋白条带. 结果表明, 已成功的表达和纯化纯度达98%的重组人CDK4蛋白.     

Abd-Bcr/Abl原核表达载体的构建和表达

构建Bcr/Abl-Abd原核表达载体,并表达、观察对白血病细胞K562的影响.以慢性白血病PGD210质粒为模板,应用聚合酶链反应(PCR)扩增出Abd编码区序列,克隆入pMD18t载体,经酶切测序鉴定正确.再通过酶切重组克隆入原核表达载体pET32a,构建pET32a-Abd重组表达质粒,经酶切、测序鉴定,序列、读码框均正确.通过转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,纯化.结果PCR扩增出特异性的501bp的目的片断,以此构建的重组质粒pET32a-Abd能够在上清中表达约36.6 kd的目的蛋白,Westem blot鉴定为特异表达.证明成功构建了原核表达载体pE732a-Abd,并表达在上清中,表达蛋白约占菌体总蛋白的6%,纯化后达到74.3%,Westem blot检测为特异性表达,为进一步研究该蛋白对慢性白血病细胞的作用奠定了分子基础.     

人细胞周期蛋白D1在大肠杆菌BL21中的表达及纯化

将人细胞周期蛋白D1全长cDNA克隆入原核表达载体pET-28c(+)中, 经酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)后获得表达菌株. 该菌株经IPTG诱导高效表达出带有组氨酸标签的以包涵体形式存在的融合蛋白, 表达量占菌体总蛋白的23%. 包涵体经洗涤和溶解， 在变性条件下利用Ni²⁺螯合柱纯化、 尿素梯度复性后， 得到纯度达98%以上的纯化蛋白. SDS-PAGE显示纯化蛋白的分子量约为43 ０００， Western-b lot分析表明， 在相应分子量处有一特异性条带， 说明成功表达和纯化重组人细胞周期蛋白D1.     

丙型肝炎病毒(HCV)截短型E2的原核表达和蛋白纯化

对丙型肝炎病毒(HCV)截短型包膜糖蛋白E2-661基因进行原核表达和纯化.利用PCR法扩增出661 bp的截短型HCV E2区基因片段,并将测序正确的E2-661基因克隆入原核表达载体pET28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE和Western-blot对表达产物进行分析和鉴定.结果表明目的蛋白分子量约为35 kDa,主要以包涵体形式大量存在.Western-blot结果显示目的蛋白与抗His标签单抗及HCV阳性血清均具有良好的反应原性.并通过镍离子亲和层析方法获得纯化的重组蛋白.以上结果为HCV E2功能的进一步研究奠定了基础.     

尘螨肠道微生物蛋白核苷二磷酸激酶的克隆、表达及纯化

根据 GenBank 中 NDP kinase 的基因序列,采用生物信息学方法将其中稀有密码子改造为大肠埃希菌常用密码子并进行二级结构优化,合成 NDP kinase 基因,构建原核表达载体 pET28a-NDP kinase 并酶切鉴定其序列,在大肠埃希菌 BL21（DE3）中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,重组产物采用镍离子金属螯合亲和层析柱纯化.经密码子改造和二级结构优化后 NDP kinase 基因长度为490 bp,其编码蛋白理论分子量为21.5 kDa,重组表达载体经酶切鉴定与理论推测结果相符,在大肠埃希菌 BL21（DE3）中该基因经 IPTG 诱导可高效表达,纯化后的重组蛋白分子量约为21.5 kDa,其单一蛋白纯度达95;以上.本研究成功构建了尘螨肠道微生物蛋白核苷二磷酸酶（NDP kinase）基因的 pET28a 原核重组质粒,为进一步研究 NDP kinase 在尘螨疫苗免疫治疗中的作用机理提供了基础.     

GST-SDF-1α融合蛋白的原核表达及纯化

构建融合重组表达载体并对其进行诱导表达蛋白以获得大量重组融合蛋白。通过PCR方法扩增出小鼠SDF-1α基因,克隆入pMD18T载体中,进行测序分析。将该基因亚克隆入原核表达载体pGEX-4T11中GST的下游构建重组质粒pGEX-4T1-SDF-1α,转化受态细胞BL21中,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE电泳检测分析。在约Mr36×103处出现一新生的蛋白条带。经灰度扫描检测,表达量约占菌体总蛋白的30%,纯化后得到了目的蛋白。成功克隆了小鼠的SDF-1α基因,并纯化融合基因GST-SDF-1α的原核表达产物。     

细粒棘球绦虫重组pET30a-EgA31疫苗的构建和诱导表达

克隆细粒棘球绦虫EgA31抗原基因,构建pET30a-EgA31原核表达载体,并在大肠埃希菌宿主系统中表达EgA31重组蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE分析.从细粒棘球绦虫成虫组织中提取总RNA,反转录生成cDNA,以此cDNA为模板RT-PCR 克隆获得EgA31抗原基因,将其克隆至pUCm-T载体,测序确定其正确性.利用定向克隆技术将EgA31抗原基因片段克隆至原核表达质粒pET30a上,转化E coli DH5α,根据选择标记的卡那霉素抗性基因筛选到阳性克隆,通过PCR分析和酶切鉴定筛选出阳性克隆.IPTG初步诱导和表达pET30a-EgA31重组蛋白,SDS-PAGE电泳检测,并经凝胶图像分析确定目的蛋白的表达水平.测序表明选取的pET30a-EgA31阳性克隆均为正确连接EgA31抗原基因的重组质粒.经IPTG诱导后重组蛋白得到成功表达,在相对分子量约为31 kDa处有表达条带,表达量约占菌体总蛋白质的26%.成功克隆并构建了pET30a-EgA31原核表达质粒.初步诱导表达出EgA31重组蛋白,为进一步研究其免疫特性奠定了基础.     

大肠杆菌葡萄糖脱氢酶基因的克隆与原核表达

克隆出大肠杆菌编码葡萄糖脱氢酶(PQQGDH)的 gcd 基因，构建了诱导型表达载体pET28a-gcd，转化大肠杆菌E. coli BL21后获得阳性克隆菌株BL21/pET28a-gcd。IPTG诱导后，经SDS-PAGE分析表明，该工程菌PQQGDH的表达量约为对照菌的18倍，约为18.2 mg/L，实现了高表达。此外，研究发现添加MgCl₂能提高PQQGDH的表达量。     

可溶性人干细胞因子的原核表达和纯化

用Trizol提取人骨髓总RNA,通过RT-PCR扩增人干细胞因子DNA,克隆到pMD18-T载体中并测序．将其定向连入原核表达载体pET32a( ),获得了重组表达载体pET32a( )／hSCF,其cDNA长度为504bp,测序结果与已知序列吻合．然后在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达,获得37kD的融合蛋白,约占菌体总蛋白量的30％．经Ni^2 -NTA树脂亲和层析柱纯化获得纯度大约90％的重组蛋白．     

油菜MKK2基因原核表达及特性分析

MAP激酶级联途径在信号传导过程中发挥着重要作用.以白菜型冬油菜"陇油6号"为材料,利用RT-PCR法克隆到全长MKK2基因cDNA,生物信息学分析表明油菜MKK2蛋白为亲水蛋白,包含有MAPKK蛋白所特有的磷酸化基序S/T-X_(3-5)-S/T.将其与大肠杆菌表达载体pET30a连接,构建原核表达载体pET30a-MKK2,并转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE以及Western blotting检测结果表明该基因表达了1个约43 kD的蛋白.实时荧光定量PCR结果显示该基因表达没有组织特异性,其转录受UV-B胁迫的诱导.     

苦荞蛋白磷酸酶2C家族的鉴定及表达分析

为了研究苦荞蛋白磷酸酶2C(PP2C)家族的成员和分类,及后续探究其在苦荞生长发育中的功能,本文利用生物信息学方法对苦荞PP2C家族进行鉴定、分类,并对其基因结构、保守基序、分子进化等进行分析.结果表明,苦荞PP2C家族有81个成员,划分为A-K的11个亚族,并且在同亚族中序列特征相似,而不同亚族间序列特征有一定差异;苦荞PP2C家族有14次基因重复事件.此外,qRT-PCR分析结果表明其A亚族基因在苦荞根、茎、叶、花、果中均有表达,除FtPP2C44外的8个基因在苦荞花、果中表达量较高;在苦荞幼苗中,除FtPP2C08外的8个基因均受ABA诱导表达量上调.上述结果揭示了苦荞PP2C家族的成员组成、序列特征、扩增和其A亚族基因的组织表达模式及受ABA诱导表达情况.     

头孢菌素C酰化酶S12在不同原核系统中的表达

目的：构建头孢菌素C酰化酶（Cephalosporin C Acylase）基因的两种原核表达载体,确定高效原核表达体系。方法：人工合成头孢菌素C酰化酶S12基因,分别克隆到含有Lac启动子的载体pBC KS和T7-lac启动子的载体pET-28a上,命名为pBC-S12和pET-28-S12,重组质粒分别转化感受态大肠杆菌DH5α和BL21（DE3）,表达纯化目的蛋白S12,测定酶活。结果：成功地构建了头孢菌素C酰化酶S12的原核表达菌株,组成型表达和诱导型表达体系的表达量低,目的蛋白具有酶活,诱导型表达产生的酶比组成型表达产生的酶具有更强活性,可作为大肠杆菌表达头孢菌素C酰化酶的高效表达体系。     

SAFB1蛋白的表达纯化及其对乳腺癌细胞抑制作用的验证

利用RT-PCR方法从7721细胞系中分离野生型SAFB1基因,将该基因分别克隆入PET28a和pcDNA3.1载体来构建原核表达及真核表达载体.重组质粒经IPTG诱导表达后亲和层析纯化,用Western印迹实验验证蛋白表达的正确性.将SAFB1基因转入MCF7中,以RT-PCR的方法检测蛋白的表达,检测其对XOR基因的调控作用及做生长曲线验证其对乳腺癌细胞抑制作用.结果证实了SAFB1对乳腺癌细胞生长抑制作用非常明显,且对XOR基因的表达有一定的抑制作用.     

家蚕抗菌肽CM4和人可溶性BAFF融合基因的克隆、表达及活性鉴定

采用PCR法从含有人可溶性BAFF基因的pET30a( )扩增得到人sBAFF基因,通过rPCR将抗菌肽Cecropin CM4基因的2条单核苷酸链进行扩增得到CM4基因,再采用over-lap PCR法通过linker将hsBAFF与Cecropin CM4融合基因相连接.经纯化和鉴定后,定向插入到原核表达载体pET30a( )中,然后转化E.coliBL21(DE3),通过实验确定了表达该融合基因的最佳诱导条件:IPTG终浓度为1.0 mmol/L,诱导时间为5 h.温度为30℃,其表达量占全菌蛋白的40%.表达产物经SDS-PAGE分析,得到相对分子质量约为22 000的重组蛋白并且存在超声裂解后的上清中.重组蛋白经Western blot检测,结果显示重组蛋白可被鼠抗人可溶性BAFF的抗体识别.采用分子筛Sephadex G-75对重组融合蛋白进行纯化,并经SDS-PAGE对其鉴定.通过对其生物学功能的检测得知,纯化后的重组融合蛋白对大肠杆菌K12D31和真菌有明显的抑菌能力.     

链球菌Fc结合蛋白G基因的克隆与原核表达

为研制SPG相关免疫试剂盒,设计了1对引物,从C群链球菌C40株基因组中扩增出了387 bp的细胞壁结合蛋白G(streptococcal protein G,SPG)基因,该基因编码125个氨基酸,包含了C1和C2两个Ig G结合结构域.构建了原核表达载体p ET28a(+)-SPG,IPTG诱导表达出分子质量约15.0 ku的SPG蛋白,并应用亲和层析柱纯化了SPG蛋白,Western blot分析表明纯化SPG蛋白具有生物学活性.     

乙型脑炎病毒E蛋白Ⅲ区基因的克隆表达及亲合层析纯化

克隆表达JEVE蛋白Ⅲ区基因,序列测定正确后进行融合表达、纯化。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）从JEVcDNA中扩增Ⅲ区基因,用限制性内切酶消化后插入到PMD-18T载体,序列测定正确后,再亚克隆到融合表达载体pET32a中。转化大肠杆菌BL21（DE3）,目的基因经IPTG诱导,由T7启动子调控表达了氨基端带6个连续组氨酸残基的JEVEⅢ区蛋白。在变性条件下对目的蛋白进行纯化,获得了融合6个组氨酸残基的JEVEⅢ区蛋白,蛋白纯度大于80%。证实构建了JEVEⅢ基因的重组表达载体,并获得了高纯度的融合表达蛋白,为以后的深入研究奠定了基础。     

人USP14蛋白在大肠杆菌中表达纯化的初步研究

采用PCR技术从人胎脑cDNA文库中克隆了usp14(ubiquitin-specific peptidase 14)基因编码区全长序列。序列分析表明人usp14基因含有peptidase蛋白酶C19A保守区,将usp14基因与pET-28b(+)载体相连,构建表达载体pET28b/usp14;把该表达载体转入大肠杆菌Rosetta(DE3)pLyS,以Isopropyl-D-thiogalactopyranoside(IPTG)诱导25°C 6小时,USP14蛋白获得高效表达。对表达产物进行Western blotting检测,并用Ni-NTA亲和层析技术获得了纯化的人USP14蛋白,表达的目的蛋白大小约为56kDa。