运用磁珠分选法建立免疫细胞共培养体系

目的以相互作用的几种免疫细胞上共同表达的抗原物质为标志,运用磁珠分选技术,从慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞中同时获得并建立体外多细胞共培养体系,体外观察细胞之间的相互作用.方法采用梯度离心法分离30例慢性乙肝病毒感染者外周血单个核细胞(PBMC),采用免疫磁珠分选法分离获得 CXCR5+细胞,通过流式细胞仪检测 CXCR5+细胞纯度和组成,并将 CXCR5+细胞进行体外培养.在分离得到的 CXCR5+细胞的基础上,将 CXCR5+细胞分为3组,分别为对照组:不加任何刺激;实验组一:加入 IL 21刺激培养,实验组二:与人肝癌细胞系(HepG2)2215细胞混合培养.体外培养一周后,流式细胞仪检测实验组与对照组细胞 B细胞数量变化,ELISA测定培养体系中上清液 HBe抗体的含量.结果1)用流式细胞仪鉴定 CXCR5+细胞的纯度和构成:CXCR5+细胞纯度为85.5±5.8%,其中 Tfh细胞占23.8±7.4%,B细胞占35.6±7.6%;2)培养7天后,IL 21刺激组 B细胞百分率为47.2±1.8%,与(HepG2)2215混合培养组 B细胞百分率为40.2±3.5%,空白对照组 B细胞百分率为36.6±7.5%,IL 21刺激组与对照组,(HepG2)2215混合培养组与对照组 B细胞百分率均有显著差异(p<0.05);3)ELISA检测培养液上清 HBeAb定量,IL 21刺激组为0.668±0.094pg/ml,空白对照组为0.378±0.088pg/ml,两组有显著差异(p<0.05).结论使用间接免疫磁珠分离法可成功建立 CXCR5+B淋巴细胞和 Tfh细胞的共培养体系,为进一步体外研究细胞之间相互关系奠定基础     

miR-34a与miR-125b在类风湿性关节炎患者外周血单个核细胞中的表达及临床意义

目的探讨miR-34a与miR-125b在类风湿性关节炎(RA)、骨性关节炎(OA)患者外周血单个核细胞(PBMCs)中的表达,并探讨其临床意义。方法以RA患者35例、OA患者15例及健康组20例为研究对象。取外周血,用淋巴细胞分离液分离出PBMCs,提取PBMCs中的总RNA,应用实时荧光定量聚合酶链反应检测miR-34a、miR-125b的表达水平,结合患者临床资料进行统计学分析。结果 RA患者miR-34a、miR-125b的表达水平低于健康组和OA组(P0.05),OA组miR-125b的表达水平低于健康组(P0.05)。RA患者miR-34a的表达水平与CRP呈正相关、与RF负相关、与ESR、anti-CCP无相关性,miR-125b与ESR、CRP呈正相关、与RF负相关、与anti-CCP无相关性。OA患者miR-34a、miR-125b的表达水平与ESR、CRP呈正相关,与RF、anti-CCP无相关性,这提示miR-34a及miR-125b的表达下调与RA和OA病情活动性可能相关。结论 RA患者外周血miR-34a和miR-125b表达下调,并与RA实验室指标有相关性,其表达水平可能与RA发生、发展、转化相关,为探讨miR-34a和miR-125b在类风湿关节炎中的作用及可能机制提供帮助。     

PD-L1在人子宫颈癌细胞异常表达并促T细胞凋亡

目的 探讨人子宫颈癌中负性协同刺激分子PD-L1的表达和它与肿瘤浸润淋巴细胞的关系以及PD-L1融合蛋白促宫颈癌患者外周血活化T细胞凋亡的作用.方法 采用免疫组化S-P法检测67例宫颈癌组织及20例正常宫颈组织中PD-L1的表达,分析PD-L1同临床病理特征的相关性,免疫荧光观察肿瘤浸润淋巴细胞数量,TUNEL法检测T细胞凋亡,体外实验将PD-L1融合蛋白细胞加入PHA刺激活化的宫颈癌患者外周血T细胞中共同培养,流式细胞术分析T细胞凋亡率和CD8+/CD4+T细胞比例.结论 正常子宫颈组织不表达PD-L1;宫颈癌组织中PD-L1的表达率为70％.宫颈癌PD-L1的表达与宫颈癌浸润深度相关(P＜0.05).PD-L1阳性病例肿瘤局部浸润淋巴细胞存在凋亡且CD8+T细胞数量明显减少;PD-L1融合蛋白组T细胞凋亡率明显高于抗PD-1组和空白对照组T细胞,分别为32.7％、18.3％和17.9％;CD8+T/CD4+T细胞的比值低于加入抗PD-1组和空白对照组,分别为0.864、0.894和0 907.结论 PD-L1在子宫颈癌中高表达且与肿瘤浸润程度及肿瘤浸润淋巴细胞数量减少有关,PD-L1能促进活化的T细胞尤其是CD8+T细胞的凋亡.     

Survivin过表达对MS1细胞Survivin基因及蛋白表达与凋亡的作用

目的 探讨Survivin过量表达对MS1细胞Survivin基因及蛋白表达与凋亡的影响.方法 构建Survivin真核表达载体,以脂质体转染MS1细胞,采用流式细胞仪的方法检测细胞凋亡;Real-time PCR和Western blot检测Survivin的mRNA及蛋白水平.结果 转染Survivin实验组与空载体对照组比较,Survivin mRNA和蛋白表达明显增高,实验组细胞凋亡率较对照组下降.结论 Survivin过表达可使MS1细胞的Survivin蛋白及mRNA高表达并能使细胞凋亡凋亡率下降,为后续的动物实验打下了理论依据.     

青蒿水提液对肺癌A549细胞的影响

目的研究青蒿水提液对肺癌A549细胞株增殖的影响和诱导凋亡的情况。方法不同浓度青蒿水提液作用于细胞不同时间,四甲基氮噻唑蓝（MTT）法检测吸光度值（A490nm）并计算增殖抑制率;AnnexinV-FITC／PI荧光染色后流式细胞仪检测细胞凋亡率;并以荧光显微镜观察细胞形态改变情况;蛋白质印迹法分析细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表这。结果青蒿水提液呈时间和剂量依赖性抑制A549细胞增殖;荧光显微镜下A549细胞出现不同时期凋亡特征性改变;流式细胞仪检测细胞凋亡率随着药物浓度增加而升高;A549细胞株的Bax蛋白表达量增多、Bcl-2蛋白表达量下降。结论青蒿水提液促进体外培养的A549细胞株增殖抑制并诱导凋亡,其机制可能与A549细胞Bax表达上调和Bcl-2表达下调有关。     

测定肿瘤细胞内外5-氟尿嘧啶含量的方法研究

目的建立了高效液相色谱法测定A549组胞内外5-氟尿嘧啶含量的方法,为探索5-氟尿嘧啶的作用机理奠定基础。方法色谱柱采用Hypersil ODS柱（4．6mm×250mm,5μm）;流动相为甲醇·水=2：98（V／V）;流速：0．8ml／min;柱温：30℃;检测波长：265nm;进样量为5μl。结果细胞内液中5-氟尿嘧啶在0.1～50．0μg/ml范围内线性关系良好（r=0．9996）,平均回收率为97．65％,RSD为0．40％,日内和日间精密度分别为1．30％,1．04％;细胞跨液中5-氟尿嘧啶在1．0～250．0μg/ml范围内线性关系良好（r=0.9999）,平均回收率为102.34％,RSD为2．11％,日内和日间精密度分别为1．32％,1．06％。结论该色谱方法简便易行,准确度高,重现性好,可用于细胞内外5-氟尿嘧啶浓度的动态变化规律研究。     

大鼠骨髓内皮祖细胞分离与体外培养条件研究

目的 探讨大鼠骨髓单个核细胞的最佳分离方法,观察不同培养条件对内皮祖细胞的生长情况、抗原表达的影响.方法 健康SD大鼠水合氯醛麻醉后断尾放血,从其骨髓中分离单个核细胞,重悬于添加不同条件培养基中,分别在预涂或未涂FN的培养瓶中进行培养,记录细胞贴壁情况、集落生成时间和数量及细胞特异性抗原的表达.结果VEGF诱导是内皮祖细胞生长分化的必需条件,在2～10 ng/mL之间,浓度越高,其对骨髓单个核细胞诱导分化的能力越强;bFGF能够协同VEGF诱导分化的作用;纤连蛋白能够明显促进骨髓单个核细胞贴壁.贴壁细胞均表迭内皮祖细胞和内皮细胞的特异性标志,各组之间没有明显差异.结论 大鼠骨髓中单个核细胞可以诱导分化为内皮祖细胞,VEGF(10 ng/mL)、bFGF(4 ng/mL)和纤连蛋白组合更有利于内皮祖细胞的增殖分化.     

可溶性重组全长人PPARγ的表达、纯化及功能表征

目的 建立可溶性表达、纯化有活性的重组全长人PPARγ蛋白的方法.方法 构建pReceiver-B13-SUMO-PPARγ质粒转化至Escherichia coli BL21(DE3)细胞,进行诱导表达,优化细胞生长环境;利用亲和色谱法纯化可溶性重组全长人PPARγ蛋白;以罗格列酮为阳性配体,以GW9662为拮抗剂,采用分子排阻色谱-高效液相色谱法(SEC-HPLC)法测定重组全长人PPARγ蛋白与配体药物的结合活性.结果 在优化条件(16℃、IPTG浓度0.4 mM、诱导时间18～20 h)下能获得高水平、可溶性重组全长人PPARγ蛋白;经亲和色谱一次纯化,得到纯度约为90％的重组全长人PPARγ蛋白;该蛋白与罗格列酮特异性结合率约为70％,Kd为500nM.结论 本文所建立的方法能可溶性表达、纯化得到有活性、纯度较高的重组全长人PPARγ蛋白,为该蛋白功能研究和配体药物筛选奠定基础.     

外加磁场对掺杂TiO2薄膜光催化活性的影响

利用外加匀强磁场辅助掺杂TiO2光催化降解偶氮胭脂红B溶液,实验探讨了外加磁场强度对Fe3 、Ni2 、Cu2 掺杂TiO2薄膜光催化活性的影响.结果 表明:外加磁场使掺杂Ni2 /TiO2、Fe3 /TiO2薄膜的光催化活性降低,在磁感应强度为0.7×10-2T时,催化剂Fe3 /TiO2几乎完全失活,光催化降解率低于2.0%,而掺杂0.5% Cu2 /TiO2薄膜的光催化活性在磁场辅助下光催化活性普遍增强,感应强度为1.0×10-2T时光催化降解率达19.4%,相当于无外加磁场时的1.2倍;理论分析指出,磁场辅助对掺杂TiO2光催化活性的影响与掺杂离子的磁导率有关.     

结肠腺癌中结肠癌干细胞的分离、鉴定

目的从人结肠腺癌组织中分离、鉴定结肠癌干细胞,并初步观察其生物学特性。方法利用新鲜结肠腺癌组织,无血清悬浮成球培养,流式细胞检测ESA、CD44表达情况,体外观察其诱导分化及CK20、Muc表达情况,Balb／C小鼠移植观察其成瘤情况。结果从人原代结肠腺癌中分离、纯化EpCAM^high CD44^＋结肠癌干细胞,结肠癌原代细胞中EpCAM^highCD44^＋细胞比例为1．7％～38％（平均5．4％）。单克隆形成实验证实结肠癌组织中存在肿瘤干细胞。其比例为（2．07±0．11）％,分离获得的EpCAM^highCD44^＋细胞能在无血清培养基中“成球”,在血清诱导下能贴壁分化;将EpCAM^highCD44^＋细胞移植在Balb／C裸鼠体内,表现出很强的致瘤性,移植瘤中EpCAM^highCD44^＋细胞比例为3．6％～43．2％（平均15．2％）,所有的移植瘤经组织学测定,均形成腺管样结构,表达结肠特异性分化标志物CK-20、中性上皮粘蛋白（neutral epithelial mucins,Muc）。结论人结肠腺癌组织中存在EpCAM^highCD44^＋细胞群,具有和普通干细胞相类似的无限增殖、自我更新和分化能力。     

刚地弓形虫RH株感染对BALB／c小鼠情绪行为的影响

目的研究刚地弓形虫RH株感染对BALB／c小鼠学习记忆行为的影响及可能机制。方法将72只周龄、大小相近的雄性BALB／c小鼠采用随机数字表分为生理盐水对照组与不同数量（3×10^3／ml、3×10^4／ml、3×10^5／m1）弓形虫RH株感染组,每组18只。于感染第5周从每组各随机抽取6只分别进行高架十字迷宫实验、旷场实验及强迫游泳实验,观察各组小鼠在实验中情绪行为变化。并记录各项指标进行统计分析。结果在高架迷宫试验与旷场实验中,3×10^3／ml弓形虫感染组小鼠与生理盐水对照组小鼠比较,各项行为学指标无明显差异。在3×10^4／ml、3×10^5／ml弓形虫感染组小鼠与对照组小鼠比较出现明显降低（P〈0．05）．以3×10^5／ml感染组最为明显,其小鼠运动活力（0E＋cE）、进入开放臂次数比例（OE％）、开放臂停留时间比例（OT％）小鼠爬行总格数、中央格在总格数中比例分别为11．08±2．12、28．73±0．59％、25．62±2．33％、32．30±17．26、2．42±0．65％。在强迫游泳试验中,各弓形虫感染组小鼠游泳的静止时间均高于对照组小鼠（P〈0．05）,3×10^5／ml感染组静止时间最长,达226．6±1．9S。结论刚地弓形虫RH株感染可引起小鼠情绪行为改变,具有焦虑抑郁倾向。     

Adenosine deaminase activity in peripheral blood cells from SJL/J mice

Summary Adenosine deaminase (ADA) activities were measured in peripheral blood cells of SJL/J mice, and compared with those of C57BL/6J animals. No association was observed between the levels of lymphocyte or erythrocyte ADA and immunologic abnormalities in SJL/J mice nor was evidence obtained to suggest a relationship between ADA activity and tumorigenesis in this strain.This work was supported in part by a University College Faculty Research Grant.     

Human peripheral blood monuclear cells transfected with messenger RNA stimulate antigen-specific cytotoxic T-lymphocytes in vitro

The efficiency of test vaccines needs to be evaluated by quantification of the triggered cellular immune response. Usually, for these assays, autologous target cells expressing the vaccine antigen are required. In the context of messenger RNA (mRNA)-based vaccinations, the target cells used for the read-out are mRNA-transfected monocyte-derived dendritic cells (Mo-DCs). Their production typically requires samples of 100 ml blood from the patients, and limits the number of assays that can be performed. We show here that fresh peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) can be transfected with mRNA by electroporation. Such cells are as efficient as mRNA-transfected Mo-DCs for their ability to activate memory T cells in vitro. Thus, mRNA-transfected PBMCs are a convenient replacement of mRNA-transfected Mo-DCs for the in vitro monitoring of natural or vaccine-induced immune responses.Received 17 February 2005; received after revision 1 May 2005; accepted 7 Juni 2005     

Lymphopenia and lymphocyte transformation in alcoholics.

The basis of peripheral blood lymphopenia observed in patients with chronic alcoholism and liver disease was investigated by examining the effect of sera of these patients on in vitro transformation of normal human peripheral blood lymphocytes. A positive correlation was demonstrated between the serum inhibition of phytohaemagglutinin- and pokeweed mitogen-induced transformation and the degree of lymphopenia. Thus serum factors may contribute to the observed lymphopenia by inhibiting lymphocyte production in vivo.     

Alkaline phosphatase in human lymphocyte subpopulations.

The levels of membrane alkaline phosphatase have been measured on different lymphocyte fractions from human peripheral blood separated on bovine serum albumin discontinuous gradients. The peak in enzyme activity was observed in a non-T-, non-B-cell fraction, rich in "null" lymphocytes; the lowest values were found in the fraction with the highest proportion of T-cells.     

肝癌细胞系Hep3B中CD133+细胞亚群的分离及其特性的研究

目的研究CD133在人肝癌细胞系Hep3B中的表达以及CD133+细胞的体外增殖、自我更新及体内成瘤能力,初步探讨肝癌中CD133+细胞亚群的干细胞特性。方法流式细胞仪检测未分选的Hep3B细胞中CD133+细胞表达情况;免疫磁珠分选技术纯化CD133+肿瘤细胞;MTT法检测CD133+细胞体外增殖能力;无血清培养纯化...