大肠杆菌O157:H7基因组研究进展

对大肠杆菌O157：H7基因组的结构、特点等近年来的研究进展进行了综述。     

冻融循环下大肠杆菌O157:H7在长春市南湖岸边水中的存活行为研究

北方地区的初春、晚秋,水体表层的夜冻昼融过程是典型特征。冻融循环过程影响水体自身理化性质,理化性质的变化对水中微生物,尤其是潜在的致病微生物的存活也会产生一定的影响。实验在室内模拟了大肠杆菌O157:H7在冻融循环条件下,在长春南湖水中的动态存活特征;并通过线性模型和Weibull模型,计算大肠杆菌O157:H7在污染水体后衰减达到最低检测限的时间(ttd);并运用多元线性回归进行相关性分析,找出影响实验菌种存活的关键因素。研究表明,南湖水的p H和氨氮与大肠杆菌O157:H7的存活相关。研究结果可为调查大肠杆菌O157:H7在湖水中的存活趋势,评估其可能带来的环境健康风险,为制定相应的环境管控措施提供科学依据。     

快速检验食品中沙门氏菌和O157:H7大肠杆菌

利用沙门氏菌快速检验装置(Oxoid公司出口）和可视免疫沉淀物（VIP）试剂盒（BioControlSystems公司出口）对广西桂林市的七星区某农贸市场的20种食品进行了沙门氏菌和O157：H7大肠杆菌的快速抽样检验，结果发现，其中的11种食品的沙门氏菌呈阳性反应，4种食品的O157：H7大肠杆菌也呈阳性反应，与目前国内普遍使用的传统检验方法相比，该方法具有快速、简便、高效、准确的特点。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7感染小鼠动物模型的初步建立

目的　建立肠出血性大肠杆菌O15 7:H7感染小鼠动物模型。方法　选用离乳小鼠随机分组 ,先以丝裂霉素和萘啶酮酸处理 ,提高小鼠对肠出血性大肠杆菌O15 7的敏感性 ,再分别以不同剂量口服接种肠出血性大肠杆菌O15 7:H7EDL933W ,进行临床和病理学检查。结果　利用对O15 7不易感的小鼠 ,复制出人类感染O15 7所出现的主要病理变化和部分临床症状 ,初步建立了动物模型。讨论　该动物模型对探索肠出血性大肠杆菌O15 7:H7的感染机制、毒力因子的作用有重要意义 ,并为O15 7:H7的疫苗侯选株安全性的评价打下初步基础。     

大肠杆菌O157∶H7胶体金免疫层析快速检测法的建立

建立一种大肠杆菌O157∶H7的胶体金免疫层析快速筛查方法.利用胶体金免疫层析技术,采用双抗体夹心法检测大肠杆菌O157∶H7,对该法进行敏感性、特异性和食品样品的适用性分析.该法能在10 min内完成检测;该试纸条仅与O157∶H7阳性样品发生特异性反应;大肠杆菌O157∶H7的最低检出浓度为1×105 cfu/mL.新建立的大肠杆菌O157∶H7胶体金免疫层析试验简便、快速,特异性和灵敏度较好,适用于现场样品的快速筛查.     

大肠杆菌O157：H7的活的非可培养状态

将大肠村菌O157：H7培养于低温养条件下,以涂布平板法（PC）和最大近似值法（MPN）检测可培养细菌数,95－115d后表明可培养菌数下降为零,吖啶橙荧光显微镜直接计数法（AODC）检测细胞总数,表明细菌总数始变化不大,而活菌直接镜检计数（DVC）检测到的活菌数保持在10^6个／ml,实验证明了大肠杆菌O157：H7在一定的条件下可进入活的非可培养状态（VBNC）。     

环亚酰胺水解酶在大肠杆菌中的重组表达与纯化

以重组质粒pEI为模板,PCR扩增环亚酰胺酶基因序列,插入pMAL-s表达载体中.重组质粒转入E.Coli BL21(DE3)后,经IPTG诱导可溶性表达融合蛋白MBP-CIH,利用Amylose亲和柱一步纯化获得MBP-CIH,再经人鼻病毒3C蛋白酶切除亲和臂MBP,硫酸铵沉淀、Phenyl-Sepharose疏水层析获得电泳纯的CIH,纯化倍数为12.7,活力回收29%,比活为36.3 U/mg.重组环亚酰胺水解酶的最适pH为8.0～9.0,最适温度50 ℃,在温度低于55 ℃时酶的性质相对稳定.Ni2 、Co2 能显著提高酶活力,Mn2 、Ca2 和Mg2 对酶活没明显有影响,Cu2 、Zn2 、Cd2 、Fe2 以及金属螯合剂8-羟基喹啉、EDTA则对酶有不同程度的抑制作用.初步说明该酶是一个金属依赖性酶.     

间接酶联免疫吸附技术检测活的非可培养状态的大肠杆菌O157：H7

大肠杆菌O157：H7在低温贫营养的条件下可进入的非可培养状态（Viable but nonculturable state,VBNC),用常规的培养法无法将其检出。作者利用间接酶联免疫吸附技术（Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测VBNC的大肠杆菌O157：H7,发现此方法可以快速有效地将其检出,最小检测浓度为10^5个／mL。     

有机磷水解酶的大肠杆菌细胞表面展示

PCR扩增来自黄杆菌ATCC27551的有机磷水解酶基因opd,直接与XcmⅠ酶切去除Ampr基因片段的pZXL-T连接,将opd克隆于锚定单元Lpp-OmpA编码序列下游,转化E.coliBL21(DE3).经抗性筛选、PCR鉴定和测序证实,成功构建了具有全细胞催化效应的大肠杆菌细胞表面展示工程菌.SDS-PAGE结果表明,工程菌能表达产生51 kD的融合蛋白.细胞表面展示的有机磷水解酶具有较高全细胞酶活性,用蛋白酶K消化处理重组菌表面蛋白可使其全细胞酶活降低90%.     

真菌纤维二糖水解酶基因的克隆与表达研究

采用能够转化细菌和真菌的双功能质粒ｐＤＬ１，与部分酶切的糙皮侧耳（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓｏｓｔｒｅａｔｕｓ）基因组ＤＮＡ片段进行体外重组。再用重组质粒ＤＮＡ转化玉米黑粉菌（Ｕｓｔｉｌａｇｏ，ｍａｙｄｉｓ）的原生质体，在平皿上筛选抗新霉素的转化子，转化率达８００转化子／μｇＤＮＡ，由此在玉米黑粉菌中建立了糙皮侧耳的基因文库。随机选出１５个转化子提取其ＤＮＡ，以３２Ｐ标记的ｎｅｕｒ基因酶切片段作为探针进行打点杂交，全部显示阳性，证明抗性菌落不是来源于敏感细胞的回复突变。以李氏木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）的纤维二糖水解酶（Ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒａｓｅｓ，简称ＣＢＨ）ＣＢＨⅡ基因末端片段为探针，从阳性克隆菌株中提取ＤＮＡ进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ转移并杂交，结果证明本研究已成功地克隆了糙皮侧耳纤维二糖水解酶ＣＢＨⅡ基因。基因的表达检测证明，克隆菌株具有纤维二糖水解酶活力。     

The Escherichia coli O157:H7 DNA detection on a gold nanoparticle-enhanced piezoelectric biosensor

This paper presents development of a quartz crystal microbalance (QCM) biosensor for real-time de- tection of E. coli O157:H7 DNA based on nanogold particles amplification. Many inner Au nanoparticles were immobilized onto the thioled surface of the Au electrode, then more specific thiolated sin- gle-stranded DNA (ssDNA) probes could be fixed through Au-SH bonding. The hybridization was in- duced by exposing the ssDNA probe to the complementary target DNA of E. coli O157:H7 gene eaeA, then resulted in a mass change and corresponding frequency shifts ( △f ) of the QCM. The outer avidin-coated Au nanoparticles could combine with the target DNA to increase the mass. The electro- chemical techniques, cyclic voltammetry (CV) and electrochemical impedance spectroscopy (EIS) were adopted to manifest and character each step. The target DNA corresponding to 2.0×103 colony forming unit (CFU)/mL E. coli O157:H7 cells can be detected by this biosensor, so it is practical to develop a sensitive and effective QCM biosensor for pathogenic bacteria detection based on specific DNA analy- sis. The piezoelectric biosensing system has potential for further applications, such as food safety and environment monitoring, and this approach lays the groundwork for incorporating the method into an integrated system for in-field bacteria detection.     

豹蛙酶的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据豹蛙酶的氨基酸序列,采用大肠杆菌偏爱密码子设计引物,重叠延伸PCR法合成出目的基因,约350bp。将得到的片断克隆于载体pGEM-T中并测序,再连接至表达载体pET-22b(+)中,重组质粒转入大肠杆菌Rosetta中。转化的重组大肠杆菌用终浓度1 mmol/L的IPTG诱导外源基因表达,采用Tricine-SDS-PAGE系统,分析目标蛋白主要以包涵体形式存在,其质量分数可达48.8%。利用液相电喷雾串联质谱方式(LC-ESI-MS/MS)鉴定蛋白,通过LCQ DECA XP Plus系统进行蛋白序列的分析,其覆盖率达到35%,确定了其蛋白质一级结构的正确性。     

肺炎克雷伯氏菌D-乳酸脱氢酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

以肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增并克隆出D-乳酸脱氢酶的基因（ldhD）,将其连接到表达载体pET-22b(+)质粒上,构建pET-22b(+)-ldhD重组质粒,测序结果100%正确。将重组质粒pET-22b(+)-ldhD转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中,通过氨苄霉素抗性平板筛选,构建大肠杆菌BL21(DE3)-pET-22b(+)-ldhD基因工程菌。重组菌株经IPTG诱导表达,SDS-PAGE蛋白电泳分析,目标条带出现在分子量约37000处,表明D-乳酸脱氢酶基因ldhD在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达。采用紫外分光光度法测定其酶活,底物丙酮酸终浓度为10mmol/L时,在丙酮酸还原为D-乳酸反应方向D-乳酸脱氢酶表现出119.04U/mL的酶活力;底物D-乳酸终浓度为50mmol/L时,在D-乳酸转化为丙酮酸的逆反应方向中表现出0.89U/mL的酶活力。比酶活则分别为9.16U/mg和 0.07U/mg。通过Lineweaver-Burk双倒数作图法,计算出酶反应的米氏常数K_M为10.54mmol/L。经摇瓶发酵后,通过高效液相色谱测定产物,D-乳酸的产量达到3.09g/L。     

大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的克隆和表达

为了更好地研究磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的结构和功能,采用PCR(聚合酶链式反应)、双酶切和细胞转化等基因工程方法对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因进行克隆并使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行表达分析,扩增出一个新的大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因,将其基因克隆到原核表达载体pET-30a上,并导入到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中。通过IPTG诱导成功表达出大肠杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。所提出的方法能够高效表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶,为进一步大规模表达纯化和应用提供参考。     

纳豆激酶基因克隆及其在大肠杆菌中活性表达研究

以纳豆芽孢杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增了纳豆激酶基因（natto kinase gene）中编码前肽、成熟肽的核苷酸序列（pro-NK），构建大肠杆菌表达质粒pTYB102，转化大肠杆菌ER2566。在IPTG诱导下，分别在15℃（14h）、30℃（3h）、37℃（2h）条件下培养，pTYB102均能表达出有活性的纳豆激酶。实验证实纳豆激酶基因得到活性表达需要Pro序列。SDS－PAGE表明，15℃和30℃和37℃培养表达的杂蛋白更少。薄层扫描测定表达的纳豆激酶占菌体总蛋白30％以上。     

米根霉L-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

文章以米根霉基因组DNA为模板,根据已公布的米根酶L-乳酸脱氢酶基因(ldnL)序列设计引物,PCR扩增得到含有ldnL的DNA片段;PCR产物T/A克隆后再双酶切,将ldnL片段连接到大肠杆菌表达载体pET17b,得到重组表达质粒pET17b-ldnL;pET17b-ldnL转化大肠杆菌BL21(DE3),摇瓶培养诱导表达后的菌体经SDS-PAGE电泳分析,结果表明克隆的ldnL基因在大肠杆菌中实现表达。     

大肠杆菌硫氧还蛋白thioredoxin基因的克隆及表达

以大肠杆菌XL1blue为模板，通过PCR技术扩增大肠杆菌硫氧还蛋白基因，并将目的基因分别连接到克隆载体pUC18和表达载体pTrcHisC上，构建重组质粒．重组质粒pTrcHisC-TRX在大肠杆菌中高效表达，最后利用固定化金属螫合亲和层析技术(IMAC)获得较纯的目的蛋白，为进一步研究硫氧还蛋白的功能及其应用提供了条件．