破囊壶菌Δ4-脂肪酸脱饱和酶基因5'端侧翼区域的克隆与鉴定

应用衔接头PCR(LA-PCR)技术,扩增得到约1000 bp的海洋破囊壶菌Δ4-脱饱和酶基因5’端侧翼区域的单一产物.对该产物测序,经启动子软件与序列比对分析,发现该序列(Genkbank登录号EU074209)具有真核启动子序列的基本结构特征,含有TATA盒、CAAT盒、INR等元件.将扩增得到的脱饱和酶基因5’端侧翼序列亚克隆到含有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的质粒pGlow-TOPO中,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌细胞.荧光显微观察大肠杆菌阳性转化子发出荧光,侧翼序列含有启动子功能得到确认.     

高产DHA海洋真菌Thraustochytrium sp.N4-103脂肪酸组成及其18S rRNA基因的克隆与序列分析

采用松花粉垂钓法分离到一株docosahexaenoic acid(DHA)高产菌Thraustochytrium sp．N4-103．该菌株细胞油脂的脂肪酸组型为47．3％DHA，11．6％C22：5(n-6)，9．4％C20：5(n-3)，9．1％C20：4(n-6)和22．6％C16：0；单细胞油脂由42．6％极性脂肪，45．3％中性脂肪和12．1％糖脂组成．细胞生长与DHA合成的最佳务件：碳源为葡萄糖，氮源为酵母膏，温度为25℃。利用PCR技术分离得到N4-103菌株18S rRNA基因并进行了克隆测序，序列含有Thraustochytrids的特征插入片段．依据18S rRNA基因序列所构建的遗传进化树表明该菌是一株与Thraustochytrium sp．KK17-3具有紧密亲源关系的未报道的破囊壶菌。     

异源四倍体鲫鲤Sox4基因部分序列及其5′端调控区启动子片段的克隆与分析

通过PCR技术从异源四倍体鲫鲤基因组DNA中分离到Sox4基因部分基序.序列分析表明,其5′端调控区具有多种启动子所特有的序列元件,如TATA框,CAAT框等,据此推测,它具有启动子活性.采用高保真PCR方法克隆了异源四倍体鱼Sox4基因5′端调控区600bp启动子片段,将其插入启动子缺失的增强绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pEGFP-1中,构建重组载体pAtsox4EGFP-1.通过瞬时转染HeLa细胞,在倒置荧光显微镜下可检测到绿色荧光.结果表明,克隆的Atsox4基因5′端调控区具有启动子活性,并成功构建了含四倍体鱼Sox4基因启动子片段的报告基因载体,为以后研究Sox4基因表达调控的分子机制奠定了基础.     

人RIP2基因启动子绿色荧光蛋白表达载体的构建与鉴定

目的:构建人RIP2基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体。方法:根据特定限制性内切酶位点,以人基因组DNA为模板,PCR扩增含人RIP2基因启动子不同长度2段序列,构建含人RIP2基因启动子驱动的绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2-RIP2(750 bp)wt、pEGFP-C2-RIP2(941 bp)wt,用VspⅠ和NheⅠ双酶切鉴定重组质粒,进行DNA序列分析,重组质粒经阳离子聚合物JetPeiTM介导转染HEK293细胞48 h后观察。结果:酶切鉴定和序列测定证实目的基因已插入重组质粒;细胞转染结果表明,重组质粒转染HEK293细胞均能表达绿色荧光,其中构建的pEGFP-C2-RIP2(750 bp)wt重组质粒绿色荧光表达强于pEGFP-C2-RIP2(941 bp)wt。结论:成功构建2段不同长度的人RIP2基因启动子绿色荧光蛋白表达载体。     

人NOD8基因启动子绿色荧光蛋白表达载体的构建与鉴定

目的:构建人NOD8基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体.方法:用特定的限制性内切酶位点,以人基因组DNA为模板,PCR扩增含有人NOD8基因启动子不同长度2段序列,并进行酶切以切除启动子的pEGFP-C2作框架结构,插入表达载体pEGFP-C2中,构建含有人NOD8基因启动子驱动的绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2-NOD8(520 bp)、pEGFP-C2-NOD8(760 bp),用Vsp Ⅰ和Nhe Ⅰ双酶切和PCR鉴定重组质粒,再将重组质粒进行DNA序列分析.构建的重组质粒经脂质体(lipofectamine)TM2000介导转染HEK293、K562和HeLa细胞,转染48 h后在倒置荧光显微镜下观察.结果:pEGFP-C2-NOD8(520 bp)、pEGFP-C2-NOD8(760 bp)分别经酶切鉴定和序列测定证实目的基因已插入重组质粒;细胞转染结果表明,构建的2段重组质粒转染HEK293、K562及HeLa细胞均能表达绿色荧光,其中构建的pEGFP-C2-NOD8(760 bp)重组质粒绿色荧光表达强于pEGFP-C2-NOD8(520 bp).结论:成功构建2段不同长度的人NOD8基因启动子绿色荧光蛋白表达载体.