甲基-β-环湖精对人类疱疹病毒6型感染性的影响

目的了解甲基-β-环糊精对人类疱疹病毒6型包膜胆固醇含量及其病毒感染性的影响.方法用不同浓度的甲基环糊精作用于HHV-6A GS株,经20%蔗糖缓冲液梯度离心,去除甲基-β-环糊精并纯化病毒,分别进行病毒胆固醇含量的测定及感染HSB-2细胞,然后采用IFA法和免疫蛋白杂交等方法检测病毒受甲基环湖精作用后,其对靶细胞的结合、融合、进入的影响以及包膜糖蛋白的表达.结果甲基-β-环糊精能去除HHV-6A包膜胆固醇,病毒的感染性遭到了破坏,但可以被外源性胆固醇所恢复.HHV-6A结合宿主细胞的能力稍微受到影响,但其感染性及诱导细胞融合的能力显著减弱,包膜糖蛋白的表达不受影响.结论HHV-6A包膜胆固醇在细胞融合过程中起着重要作用,同时也是病毒进入宿主细胞的关键因素.     

AG490下调STAT3活化增强葫芦素B对B16F10黑素瘤细胞的抑制作用

目的:研究Jak2/STAT3特异性抑制剂AG490对葫芦素B(CuB)抑制B16F10黑素瘤细胞效应的影响,并探讨其作用机制.方法:用MTS法检测细胞增殖状态;用碘化丙锭(PI)染色分析细胞凋亡和细胞周期分布;用免疫印迹检测p-STAT3以及STAT3蛋白的表达情况.结果:CuB以时间与浓度依赖方式抑制BI6F10黑素瘤细胞的生长,AG490预处理能增强CuB对B16F10细胞的抑制作用;PI染色分析显示,AG490能增强CuB诱导B16F10细胞凋亡的比率;免疫印迹检测表明,CuB引起Bi6F10细胞中STAT3的活化(p-STAT3),AG490能明显下调pSTAT3蛋白的表达水平.结论:阻断Jak/STAT3的活化可增强CuB对B16F10黑素瘤细胞的抑制作用.     

NGF诱导PC12细胞转化为神经样细胞微管相关蛋白2(MAP2)的表达

目的探讨神经生长因子(NGF)诱导PC12细胞分化为神经元样细胞时MAP2的表达变化情况.方法细胞培养6 d后应用共聚焦显微镜观察MAP2表达情况;Western Blot法检测诱导不同时间点MAP2的表达情况.结果免疫组化结果显示:MAP2表达呈阳性;免疫印迹结果显示:MAP2蛋白表达在不同时间点呈动态变化,即随诱导时间延长呈递增趋势.结论 NGF成功诱导PC12细胞分化为神经样细胞,为缺血性脑卒中的体外细胞研究提供细胞参考.     

绿脓杆菌外毒素A与Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白嵌合表达质粒的构建及其免疫原性的研究

构建外毒素结构域Ⅰ a基因(EPA103)与Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白(HSV-2-gD)嵌合蛋白表达载体(pET-EgD),得到嵌合表达蛋白.利用外毒素结构域Ⅰ a基因表达蛋白的佐剂效应,以pET-EgD表达嵌合蛋白免疫Balb/c小鼠.结果显示:嵌合表达蛋白(pET-EgD)免疫小鼠,可在小鼠体内诱导产生抗HSV-2特异性抗体.嵌合表达蛋白(pET-EgD)具有较强的免疫原性,为开发研究Ⅱ型单纯疱疹核酸疫苗奠定了基础.     

采用重组小鼠凝血因子Ⅸ制备单克隆抗体的研究

将小鼠凝血因子Ⅸ (mFⅨ )cDNA蛋白编码区序列克隆至原核表达载体 pQE30 ,在大肠杆菌M 15中获得高效表达 (约占细菌蛋白总量的 5 1 2 % ) ,并经过SDS PAGE纯化获得均一的重组mFⅨ蛋白 .以此蛋白为抗原 ,免疫Lou/MN系大鼠 ,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞 (Sp 2 / 0 )融合后 ,经 3次克隆化选择获 2株杂交瘤细胞(H4B5和C2B10 ) .以 1× 10 6杂交瘤细胞注射免疫缺陷型裸鼠 ,10d后获得腹水 .对此单抗的功能和特异性初步研究表明 ,所制备的抗小鼠FⅨ单抗可用于Western免疫印迹等研究 .     

HCV包膜糖蛋白基因真核表达载体的构建及其在HepG2中的瞬时表达

通过PCR法扩增出HCV包膜糖蛋白E1-E2的全长基因片段.将测序正确的片段克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建HCV包膜糖蛋白基因真核表达载体.再采用脂质体法转染肝癌细胞系hepG2,利用RT - PCR、Western blot等方法对目的基因的转录与表达进行分析与鉴定.结果表明所构建的含有HCV包膜糖蛋白E1-E2基因的真核表达载体在HepG2细胞中能瞬时表达.重组真核质粒的构建及表达为下一步建立稳定转染细胞系及进一步研究HCV包膜糖蛋白的功能奠定了基础.     

天花粉蛋白抗单纯疱疹病毒1型的实验研究

检测用基因工程方法制备的天花粉蛋白抗单纯疱疹病毒1型的活性。将单纯疱疹病毒1型在细胞系中培养．加入天花粉蛋白后,观察细胞病变情况,用酶联免疫吸附（ELISA）的方法检测病毒生长情况。结果显示,加入天花粉蛋白的细胞始终未见细胞病变,ELISA检测为阴性;阴性对照组细胞在第3d以后均出现单纯疱疹病毒1型感染典型细胞病变．ELISA检测结果为阳性;阳性对照组始终未见单纯疱疹病毒1型感染典型细胞病变,ELISA检测结果为阴性。天花粉蛋白在体外培养细胞系中可以抑制单纯疱疹病毒1型。     

乙型肝炎病毒促进肝细胞PD-L1蛋白表达机理

为了研究乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)能否借助肿瘤细胞的抗免疫机制来逃逸机体免疫,利用HBV感染去肝细胞,研究受感染后的肝细胞对宿主免疫应答的变化.通过实时荧光定量PCR的方法分析HBV感染后的肝细胞内Axin和PD-L1的转录水平,发现HBV不影响Axin和PD-L1的转录水平,采用蛋白免疫印迹技术发现HBV能下调肝细胞内Axin蛋白水平,同时上调PD-L1蛋白水平.进一步在细胞内转染表达HBV的组成蛋白的质粒,通过蛋白免疫印迹技术发现HBV的组成蛋白HBx能下调细胞内Axin蛋白的表达.通过数据相关性分析以及泛素化实验发现,Axin能通过增加PD-L1的E3泛素连接酶SPOP的表达,促进PD-L1泛素蛋白酶体降解.进一步对PD-L1的泛素化方式进行探讨,发现Axin促进PD-L1的K48依赖的泛素化降解作用.结果表明,HBV可能通过HBx下调Axin和SPOP蛋白水平,抑制PD-L1泛素化降解,进而逃逸宿主免疫应答.本研究揭示了HBV免疫逃逸新机制,为治疗HBV奠定了新的基础,在一定程度上推动了抗HBV药物开发.     

过表达Vav1蛋白对乳腺癌细胞系T47D细胞增殖的影响

Vav1是造血系统中的重要蛋白,具有鸟苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factor,GEF)活性,能够催化Rac/Rho GTP酶的活性,从而参与众多的细胞事件,如细胞骨架重组,基因的转录,免疫细胞的发育和活化,细胞增殖和凋亡等.近年来,在包括乳腺癌在内的人类癌症中均发现有Vav1的表达,但对于Vav1在乳腺癌细胞中的具体功能和机制仍不清楚.本研究中,通过慢病毒包装系统感染乳腺癌细胞系T47D构建了稳定表达Vav1的乳腺癌细胞系,通过WST-1检测细胞增殖和细胞流式法检测细胞周期发现Vav1能够促进细胞增殖,同时通过蛋白免疫印迹技术和报告基因系统发现这一过程可能跟Vav1增强转录因子NF-κB转录活性上调细胞周期相关蛋白Cyclin D1相关.     

人源性14-3-3σ真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建人源性14-3-3σ真核表达载体pCMV-Myc-SFN,并观察其在真核细胞中的表达。方法：通过反转录-聚合酶链反应从HeLa细胞（人宫颈癌细胞系）中获得编码14-3-3σ的cDNA,定向克隆至真核表达载体pCMV-Myc中,经酶切和测序鉴定正确后,应用脂质体法转染HeLa细胞,并通过蛋白免疫印迹法检测细胞内14-3-3σ的表达。结果：构建了真核表达载体pCMV-Myc-SFN,将其转染HeLa细胞48h后,蛋白免疫印迹法检测到细胞内14-3-3σ的表达显著增高。结论：成功构建了真核表达载体pCMV-Myc-SFN,为研究14-3-3σ在上皮细胞源性肿瘤中的作用奠定了基础。     

Acquisition of the human adeno-associated virus type-2 rep gene by human herpesvirus type-6.

Human herpesvirus type-6 (HHV-6) is a recently isolated herpesvirus which is highly prevalent in adult populations around the world. HHV-6 was first isolated from the peripheral blood of six individuals with lymphoproliferative disorders, two of whom were also infected with human immunodeficiency virus. HHV-6, in common with other herpesviruses, transactivates the HIV long terminal repeat linked to reporter genes and has in addition been shown to accelerate HIV gene expression and CD4 cell death in cultures co-infected with both viruses. The virus is tropic for CD4+ lymphocytes and persists in the peripheral blood of most seropositive individuals. We have now identified a gene in HHV-6 encoding a 490-amino-acid polypeptide homologous to the human adeno-associated virus type-2 (AAV-2) rep gene. This gene has an essential role in AAV-2 DNA replication, can trans-regulate homologous and heterologous gene expression, and inhibits cellular transformation. The acquisition of rep by HHV-6 could be due to natural transfer of genetic information between DNA viruses of eukaryotes and is likely to have important consequences for the life-cycle of HHV-6 and for the host CD4 cell.     

Productive dual infection of human CD4+ T lymphocytes by HIV-1 and HHV-6

Although infection by HIV-1 has been implicated as the primary cause of AIDS and related disorders, cofactorial mechanisms may be involved in the pathogenesis of the disease. For example, several viruses commonly detected in AIDS patients and capable of transactivating the long terminal repeat of HIV-1, such as herpesviruses, papovaviruses, adenoviruses and HTLV-I have been suggested as potential cofactors. Another candidate is human herpesvirus-6 (HHV-6, originally designated human B-lymphotropic virus), which has not only been identified in most patients with AIDS by virus isolation, DNA amplification techniques and serological analysis, but is also predominantly tropic and cytopathic in vitro for CD4+ T lymphocytes. Here we demonstrate that HHV-6 and HIV-1 can productively co-infect individual human CD4+ T lymphocytes, resulting in accelerated HIV-1 expression and cellular death. We also present evidence that HHV-6 transactivates the HIV-1 long terminal repeat (LTR). These observations indicate that HHV-6 might contribute directly or indirectly to the depletion of CD4+ T cells in AIDS.     

PCR和原杂交技术检测鼻咽癌石蜡组织中HHV-6DNA

为了解人疱疹病毒６型（ＨＨＶ－６）与鼻咽癌（ＮＰＣ）的可能关系，检测了ＮＰＣ发生不同阶段的石蜡组织中ＨＨＶ－６ＤＮＡ的存在情况。方法：采用ＰＣＲ、斑点杂交和原位杂交技术，共检测了４２例鼻咽癌石蜡组织、２１例鼻咽癌前病变石蜡组织和２７例正常鼻咽石蜡组织ＨＨＶ－６ＤＮＡ的存在情况。结果：通过ＰＣＲ扩增，在４２例ＮＰＣ组织中检出１３例存在ＨＨＶ－６ＤＮＡ，占３１％；２１例鼻咽癌前病变组织中１例阳性（４７％），而２７例正常鼻咽组织中无一例阳性。斑点杂交的结果表明ＰＣＲ扩增是ＨＨＶ－６特异的。原位杂交发现，在１３例ＰＣＲＨＨＶ－６阳性的ＮＰＣ组织中１１例ＨＨＶ－６ＤＮＡ阳性。ＨＨＶ－６ＤＮＡ主要分布于癌巢的肿瘤细胞核内，少数亦可见于癌旁的异型细胞，但在淋巴细胞及正常上皮细胞内未发现阳性信号。结论：本实验用分子生物学技术首次证明，在中国ＮＰＣ患者的鼻咽石蜡组织中存在ＨＨＶ－６。ＨＨＶ－６与ＮＰ相关，并有可能在ＮＰＣ的癌变过程中起一定的作用     

人类疱疹病毒6型感染与风湿性关节炎关系的研究

目的 探讨人类疱疹病毒6型(HHV-6)与风湿性关节炎之间的关系.方法 采用巢式PCR方法检测38例风湿性关节炎患者外周血单个核细胞和血清中的HHV-6-DNA.结果 风湿性关节炎患者HHV-6-DNA阳性率为55.26%,而对照组为52%,两组比较无显著性差异(P＞0.05).部分患者血清中存在HHV-6-DNA,提示这些患者可能存在HHV-6活动性感染.结论 HHV-6感染与风湿性关节炎相关.     

Expression of human clotting factor Ⅸ mediated by recom- binant lentiviral vector in cultured cells and hemophilia B mice

To explore the expression of human clotting factor Ⅸ (hFⅨ) cDNA in vitro and the feasibility of gene therapy for hemophilia B mice mediated by recombinant lentiviral vector, a recombinant hFⅨ lentiviral vector driven by ubiquitin-C promoter, FUXW, and by ABP liver specific promoter, FAXW, was constructed respectively. Recombinant lentivirus was harvested from 293T cells by calcium phosphate-mediated transient cotransfection of three plasmids (transgene vector, CMV腞8.2, VSV-G). hFⅨ expression was detected in supernatant of 293T, BHK and L-02 cells infected with FUXW virus, whereas higher expression of hFⅨ levels (630 ng/106 cells/48 h) was detected only in L-02 cells infected with FAXW virus. Serum hFⅨ antigen was detected in all hemophilia B mice treated with FAXW virus by tail vein injection, an efficiency level of hFⅨ was observed (45 ng/mL, approximately 1% of normal human levels), the expression lasted for more than 60 d. The results indicated that HIV-based lentiviral vectors offer a promising approach to the gene therapy of hemophilia B.     

重组痘苗病毒对不同哺乳动物细胞株的感染效率及EGFP表达水平研究

研究重组痘苗病毒对不同哺乳动物细胞的感染效率及表达水平，可为痘苗病毒表达系统宿主细胞的正确选择提供依据．本研究利用重组绿色荧光蛋白基因的痘苗病毒WR—EGFP同时感染不同的哺乳动物细胞株，利用流式细胞仪检测EGFP的表达强度．共使用20种哺乳动物细胞株，其中10种人类组织细胞，2种猴组织细胞。8种小鼠组织细胞．结果表明，重组痘苗病毒wR-EGFP对鼠细胞系BHK21和人细胞系A-549的感染效率和表达效率最佳；整体看，痘苗病毒对多数灵长类动物细胞的感染效率和表达效率优于鼠细胞；对贴壁细胞的感染效率和表达效率明显优于悬浮细胞；但没有特别的组织偏嗜性。     

乙型肝炎病毒蛋白及COX-2在乙肝相关性肝细胞癌发展与转移中的作用机制

目的探讨乙型肝炎病毒蛋白及环氧合酶-2(COX-2)在乙肝相关性肝细胞癌发展与转移中的作用机制.方法取42例慢性乙肝患者行穿刺活检时乙型肝炎病毒ccc DNA为阳性乙肝相关性肝细胞癌组织;另取同期手术切除的11例ccc DNA为阴性的非乙型肝炎相关性肝癌组织.免疫组化法检测乙型肝炎病毒X蛋白、COX-2、CD34的表达水平,Werdner法计算微血管密度;分析上述因子与乙肝相关性肝细胞癌组织微血管生成的相关性.RT-PCR和Western blot检测人肝癌细胞系(HepG2)和稳定转染乙型肝炎病毒X蛋白(HepG2-X)细胞中COX-2mRNA和蛋白表达情况;ELISA法检测细胞上清液中PGE2表达水平和不同浓度COX-2抑制剂塞来昔布作用后PGE2水平.结果乙型肝炎病毒X蛋白阳性表达组织中COX-2阳性率明显高于乙型肝炎病毒X蛋白阴性表达组织和非乙型肝炎相关性肝癌组织(P0.01).乙型肝炎病毒X蛋白阳性表达组织中早期癌症微血管密度明显低于进展期癌症组织,乙型肝炎病毒X蛋白阴性表达组织中微血管密度明显低于阳性表达组织(P0.01);COX-2阳性表达组织中微血管密度明显高于COX-2阴性表达组织(P0.01);非乙型肝炎相关性肝癌组织中微血管密度明显低于乙型肝炎病毒X蛋白、COX-2阳性表达组织(P0.01),与乙型肝炎病毒X蛋白阴性表达组织和COX-2阴性表达组织之间差异无统计学意义(P0.05);乙型肝炎病毒X蛋白、COX-2在乙型肝炎相关性人肝细胞癌组织微血管生成呈正相关.HepG2-X细胞中COX-2 mRNA和蛋白表达水平明显高于空载体对照HepG2细胞,并且细胞培养上清液中PGE2水平明显增加;与HepG2细胞相比,塞来昔布对HepG2-X细胞分泌PGE2具有更强的抑制作用.结论乙型肝炎病毒X蛋白、COX-2在乙肝相关性肝细胞癌组织中高表达,促进了癌组织微血管生成;乙型肝炎病毒X蛋白可通过COX-2/PEG2信号通路促进了肝癌的发生和发展.     

冷刺激下副溶血弧菌基因转录表达变化分析

目的:应用全基因组DNA芯片技术分析从37℃转入10℃后冷刺激作用下副溶血弧菌基因转录表达变化。方法:10℃低温分别作用于副溶血弧菌20、40和60min后,收集以上3个时间点和正常对照组的菌体,提取RNA,进行一个连续的时相分析。在每一个时间点的细菌基因表达分别与对照组(冷处理前37℃生长状态)相比较,获取每个时间点和正常对照组的基因转录表达上下调的倍数或者其对数值,以荧光信号的变化倍数值为2作为一个临界点,结合SAM分析软件选取基因变化倍数较大的数值。结果:在冷刺激后20、40、60min3个时间点可以检测到大量的转录水平发生明显变化的基因,对于这些发生变化的基因,根据各个时间点的变化规律,进行了分簇归类分析,共分为9簇,每一个簇都存在一种独特的时间依赖的表达模式。在每个相关的时间点,代谢相关的基因以下调为主。面对突然而急剧的温度变化,细胞膜相关的代谢基因发生了明显的重塑。结论:通过对体外低温环境下副溶血弧菌的比较转录谱分析,得到了在低温条件下基因转录发生明显变化的细胞代谢和毒力因子等相关基因,为副溶血弧菌基因转录调控网络的研究提供了一定的理论依据。     

癌细胞C-myc蛋白对他莫昔芬的应答

目的:观察C-myc蛋白在胃癌细胞系BGC823中的表达情况,探讨胃癌细胞BGC823经他莫昔芬(TAM)处理后,C-myc蛋白表达的变化.方法:使用10 5MTAM处理胃癌BGC823细胞系24 h后,通过免疫荧光细胞化学的方法及细胞计数,检测C-myc蛋白的表达变化,并通过WST1法检测细胞活力的变化.结果:C-myc在胃癌BGC823中高表达,经10 5 M TAM处理24 h后BGC823细胞活力明显下降(P<0.05,)同时C-myc的表达减弱(P<0.05).结论:C-myc在胃癌细胞BGC823中发挥生物学作用且与TAM介导的BGC823细胞活力下降相关.