大肠杆菌青霉素G酰化酶Trp~(572)残基的定点突变研究

大肠杆菌青霉素G酰化酶(PGA,EC3、5、1、11)催化青酶素G侧链的水解,是半合成抗生素工业中的重要应用酶。生物合成的PGA由一个α亚基和一个β亚基共同组成,它的一级结构已全部搞清,但其空间结构尚未见报道,Mahajan曾用2-硝基苄氧磺酰氯和2-羟基     

猪肾氨基酰化酶Ⅰ的初步晶体学研究

氨基酰化酶Ⅰ(aminoacylase I,ACY-1)(3.5.1.14)主要存在于哺乳动物的肾脏和微生物中,是生物体进行氨基酸代谢时一个重要的水解酶,它可逆地催化酰化L-氨基酸的水解反应.该酶由772个氨基酸组成,分子量为85.500ku,是一个寡聚酶,由两个相同亚基组成,每个亚基含有一个锌离子.猪肾ACY-1与人的ACY-1的核酸序列有88.3%的同源性,氨基酸序列的同源性为87.7%.将猪肾ACY-1的氨基酸序列放在PROSITE数据库中检索,除了几个潜在的蛋白激酶磷酸化的位点和2个可能的N-糖基化位点外,没有其他明显的特征.把猪肾ACY-1的核酸序列和氨基酸序列与EMBL/GenBank和SwissProt Database中的序列进行比较,除了由E.coli表达的酰氨酶(amidase,succinyl-diaminopimelate desuccinylase),没有发现它与其他蛋白质有同源性,Wilbur-Lipman Algorithm统计分析表明,酰氨酶与猪肾ACY-1序列在400个氨基酸长度内有24%的等同性、这些结果提示,ACY-1是一类新的含锌金属蛋白.张艳等人用CD和FTIR谱对它的二级结构进行了研究.     

猪肾氨基酰化酶Ⅰ的初步晶体学研究

<正>氨基酰化酶Ⅰ(aminoacylase I,ACY-1)(3.5.1.14)主要存在于哺乳动物的肾脏和微生物中,是生物体进行氨基酸代谢时一个重要的水解酶,它可逆地催化酰化L-氨基酸的水解反应.该酶由772个氨基酸组成,分子量为85.500ku,是一个寡聚酶,由两个相同亚基组成,每个亚基含有一个锌离子.猪肾ACY-1与人的ACY-1的核酸序列有88.3%的同源性,氨基酸序列的同源性为87.7%.将猪肾ACY-1的氨基酸序列放在PROSITE数据库中检索,除了几个潜在的蛋白激酶磷酸化的位点和2个可能的N-糖基化位点外,没有其他明显的特征.把猪肾ACY-1的核酸序列和氨基酸序列与EMBL/GenBank和SwissProt Database中的序列进行比较,除了由E.coli表达的酰氨酶(amidase,succinyl-diaminopimelate desuccinylase),没有发现它与其他蛋白质有同源性,Wilbur-Lipman Algorithm统计分析表明,酰氨酶与猪肾ACY-1序列在400个氨基酸长度内有24%的等同性、这些结果提示,ACY-1是一类新的含锌金属蛋白.张艳等人用CD和FTIR谱对它的二级结构进行了研究.     

用~1H NMR研究活性氧对CuZn-SOD结构的影响

铜锌超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)是一金属酶,它由2个亚基组成,每个亚基各含有1个Cu(Ⅱ)和一个Zn(Ⅱ),其中Cu(Ⅱ)与His_(44),His_(46),His_(61),His_(118)及1个水分子配位,Zn(Ⅱ)与His_(61),His_(69),His_(78)及1个天冬氨酸残基配位.业已进行的研究证明该酶能耐受多种物理和化学因素的作用而保持结构和功能的完整性,但它对某些活性氧体系却异常敏感,已经证实H_2O_2     

氨基酰化酶在低浓度脲溶液中的失活并非解聚所致

氨基酰化酶(Aminoacylasc,EC3.5.1.14)是一个含金属锌离子的二聚体酶,亚基分子量约为43 000.Zn~(2 )位于每个亚基的活性部位上,且为酶的活性所必需,过去的研究结果表明锌离子对酶活性部位结构有一定的稳定作用,最近报道的氨基酸序列表明,该酶分子中有16个色氨酸残基和18个酪氨酸残基.我们已经知道16个色氨酸残基中部分位于分子     

绿豆线粒体的氧化磷酸化的偶联因子

在动物和微生物的线粒体中已经证明ATP酶复合体是生物转能的关键装置,它的“头-柄-基部”三联体结构的三个部分的结构、亚基组成和功能,以及它们之间的相互关系已有许多报道。它的头部,即可溶性偶联因子F_1已从ATP酶复合体拆离下来,进行了纯化,得到了结晶,并进行了偶联因子F_1亚基的拆离和重组。然而,在高等植物中,迄今只有Grubmeyer和Spencer曾对豌豆线粒体的ATP酶和偶联因子F_1作过分离和初步提纯。但是,植物线粒     

钙调神经磷酸酶在CaM,Mn~(2+)存在时的构象变化

钙调神经磷酸酶(Calcineurin,CaN)是由A,B两亚基1:1组成的二聚体酶.A亚基是CaN的催化亚基,上有钙调素(CaM)、B亚基和金属离子结合位点.B亚基是调节亚基,上有4个Ca~(2+)结合位点,在维系酶的活性构象方面起着重要的作用.肖方祥等用Mn~(2+)作为Ca~(2+)探针进行了CaN,CaN+CaM结合Mn~(2+)的ESR研究,其结果表明,CaN上有2个Mn~(2+)结合位点,然而分离的A,B亚基上分别有2个、4个Mn~(2+)结合位点,CaN-CaM复合物     

植物青枯菌M2细菌素及其亚基的研究

青枯菌(Pseudomonas solanacearum)是一种世界性的重要病原菌,可以引起33科200多种植物的青枯病。本文在文献[2,3]的基础上,对该细菌素的性质,尤其是它的两个亚基的生物活性做了进一步的研究,并测定了两个亚基的N端氨基酸序列,为该细菌素基因的分子克隆提供了理论依据和物质基础。     

叶绿体ATP合酶CF1与CF0亚基间的相互作用

通过PCR的方法得到波菜叶绿体ATP合酶9个亚基的编码序列,分别克隆到质粒pGBT9和pGAD424,双转化入酵母菌株HF7C和SFY526,用酵母双杂交系统检测菜叶绿体ATP合酶各亚基间的相互作用,同时用双杂交系统和体外结合实验检测γ亚基与ε亚基及ε亚基突变体ε△N21,ε△C45之间的相互作用,实验结果基本上支持目前关于细菌ATP合酶的结构模型,与之不同是,δ亚基与β,γ,ε以及CF0的Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ亚基均有作用,这些说明尽管叶绿体ATP合酶与细菌ATP合酶有着类似的亚基组成和空间结构,但在亚基间的相互关系和催化过程中的构象变化上可能有所不同。     

茎尖培养与去病毒技术

引言植物病毒病的危害性是众所周知的,它严重地影响着植物产品的质量和产量,更严重地影响一些植物商品和原种的出口,因为检疫问题十分困难和麻烦。因此,当前在生产上提出了一个极为重要的课题——植物病毒病的防治研究。由于病毒病原是一类结构非常简单的分子生物,大部分是由核酸和蛋白质分子组成(只有极少数的病毒含有脂类和转录酶),其核酸为芯子,蛋白质亚基为外壳。对植物病毒来说,其核酸成分主要是RNA(核糖核酸)。正因为病毒的结构很简单,自己     

叶绿体ATP合酶CF_1与CF_0亚基间的相互作用

通过PCR的方法得到菠菜叶绿体ATP合酶9个亚基的编码序列, 分别克隆到质粒pGBT9和pGAD424, 双转化入酵母菌株HF7C和SFY526, 用酵母双杂交系统检测菠菜叶绿体ATP合酶各亚基间的相互作用. 同时用双杂交系统和体外结合实验检测 g 亚基与e亚基及e亚基突变体eDN21, eDC45之间的相互作用. 实验结果基本上支持目前关于细菌ATP合酶的结构模型. 与之不同的是, d 亚基与b, g, e 以及CF0的Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ亚基均有作用. 这些结果说明尽管叶绿体ATP合酶与细菌ATP合酶有着类似的亚基组成和空间结构, 但在亚基间的相互关系和催化过程中的构象变化上可能有所不同.     

胍变性的OPTA标记的肌酸激酶的再折叠研究

变性的完整蛋白质分子在体外再折叠的研究虽然不能完全模拟体内新生肽链的折叠,然而它可以对蛋白质的折叠提供一些有用的信息.因此近年来对于变性蛋白质再折叠的研究引起了人们广泛的重视.过去我们曾经研究了经脲或盐酸胍变性的肌酸激酶的再折叠与复活,发现在适当的条件下,变性的肌酸激酶可以再折叠至接近天然构象状态,酶活力亦可恢复至接近初始酶活力.比较再折叠与复活的动力学过程,发现酶分子再折叠和复活不是同步进行,在再折叠基本完成之后,酶的复活尚有一个很长的慢过程.我们曾用OPTA专一性的标记酶的活性部位,形成一个荧光基团,以此为探针探测在低浓度脲溶液中失活时活性部位的构象变化.在本文中,我们用这个荧光探针,探测了在胍变性肌酸激酶再折叠过程中,酶的活性部位的构象变化过程,并与整个分子的再折叠和酶的复活过程进行了比较研究.     

光驱动F_oF_1-ATP合酶复合物顺时针旋转的观察

将含有10个组氨酸的嗜热菌F1b亚基通过杂交引入光合细菌载色体(Chromatophores)复合物的FoF1-ATP合酶中.对该杂交复合物的生化性质研究表明,其具有较好的质子转运能力,杂交的FoF1-ATP合酶能够有效地催化载色体的光合磷酸化,其F1b亚基的10个组氨酸可与Maleimido-C3-NTA连接后再与FITC标记的肌动蛋白微丝连接.光照后在荧光显微镜下观察到,与该杂交复合物b亚基连接的荧光微丝顺时针方向旋转,即质子动力势(pmf)引起的FoF1-ATP合酶F1b亚基(或a3b3六聚体)上荧光微丝的顺时针方向旋转.初步建立了FoF1-ATP合酶在pmf推动下F1b亚基(或a3b3六聚体)旋转的研究体系.     

甘油脱水酶的理性设计:基因杂合改善酶的性质

1,3-丙二醇是一种重要的化工原料, 越来越受到广泛的关注. 以弗氏柠檬酸菌和克雷伯氏菌的总DNA以及宏基因组为模板, 克隆并表达了3个不同来源的甘油脱水酶基因, 前两者均有活力, 而后者则没有活力. 为了改造甘油脱水酶使其更有利于工业化生产, 通过同源建模(homology modeling)构建了这3个甘油脱水酶的三维结构, 并利用一些生物信息学软件对这3个甘油脱水酶进行亚基之间的杂合改组(gene swapping)的理性设计, 根据设计结果对这3种不同来源的甘油脱水酶的大、中小亚基基因分别进行了克隆. 通过基因交换的方法对甘油脱水酶大、中小亚基进行了杂合, 得到6种异源亚基杂合酶. 部分杂合酶的酸碱稳定性、热稳定性及V_max得到了明显的改善, 同时杂合改组使本没有活力的来源于宏基因组的甘油脱水酶具有了活力而且杂合酶的热稳定性也得到了显著提高. 根据构建的三维结构分析了结构差异对酶学性质的影响.     

光驱动F0F1-ATP合酶复合物顺时针旋转的观察

将含有10个组氨酸的嗜热菌F1β亚基通过杂交引入光合细菌载色体(Chromatophores)复合物的F0F1-ATP合酶中. 对该杂交复合物的生化性质研究表明, 其具有较好的质子转运能力, 杂交的FoF1-ATP合酶能够有效地催化载色体的光合磷酸化, 其F1β亚基的10个组氨酸可与Maleimido-C3-NTA连接后再与FITC标记的肌动蛋白微丝连接. 光照后在荧光显微镜下观察到, 与该杂交复合物β亚基连接的荧光微丝顺时针方向旋转, 即质子动力势(pmf)引起的FoF1-ATP合酶F1β亚基(或α3β3六聚体)上荧光微丝的顺时针方向旋转. 初步建立了F0F1-ATP合酶在pmf推动下F1β亚基(或α3β3六聚体)旋转的研究体系.     

水稻核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶的固定化及其亚基的重组作用

核酮糖1,5-二磷酸(RuBP)羧化酶/加氧酶(EC4,1,1,39)是一个双功能酶,该酶在植物产量形成中起着关键性的作用。高等植物的RuBP羧化酶是由叶绿体DNA编码的8个大亚基和细胞核DNA编码的8个小亚基组成。已知大亚基具有催化作用所必需的RuBP结合部位和氨基甲酰化形成的部位。然而,小亚基的功能至今仍不清楚。解离和重组实验     

植物NAD-IDH基因克隆及体外表达酶活力分析

植物NAD⁺-依赖型异柠檬酸脱氢酶(NAD-IDH)是一多功能酶. 以拟南芥生态型“Columbia gl1”及甘蓝型油菜三系“陕2A”, “陕2B”和“垦C1”的叶片为材料, 采用RT-PCR方法成功地从每种植物材料中分别克隆了3种NAD-IDH不同亚基基因. 同源性搜索发现, 来源于油菜的克隆基因是新基因. 将克隆基因的功能蛋白编码区整合到pMID1多克隆位点, 构建表达重组体, 均能在体外翻译系统中高效地表达出特异目的蛋白. 亚基0, 亚基1和亚基2基因转录本加入到含终浓度为36 μg/mL的二硫键异构酶的体外翻译系统, 体外表达产物中检测到NAD-IDH酶活力. 不同基因种类及转录本分子比的体外表达产物的酶比活力比较表明, NAD-IDH由3种亚基组成, 缺一不可, 缺少亚基0是致命的, 缺少亚基1或2中的任何一个对酶活力的损伤是严重的. 同时发现, 来源于陕2A和陕2B的亚基1基因转录本中存在碱基缺失现象, 从而发生移框突变或无义突变, 使突变亚基不表现正常亚基1功能, 导致油菜品系间叶片NAD-IDH酶比活力存在差异.     

钼铁蛋白类晶体的电子显微观察

等和等曾用电子显微镜研究固氮酶钼铁蛋白的结构,认为钼铁蛋白是由四个球状的亚基组成。1974年,Stasny等通过电子显微镜观察,确定钼铁蛋白分子由四个类似球状的亚基组成,排列成90×90×40的直角平行六面体。同年我们也观察到由钼铁蛋白分子井然有序地排列成的类晶体,并对其分子构型作了研究。     

枯草杆菌蛋白酶E的分子置换研究

枯草杆菌蛋白酶是产生于芽孢杆菌的一种碱性蛋白酶。该类酶的肽链折叠方式完全不同于哺乳动物丝氨酸蛋白酶,但两者起催化作用的残基都是一样的,并具有几乎完全相同的空间配置,因而属两类不同的丝氨酸蛋白酶。枯草杆菌蛋白酶的结构和功能受到了深入研究,该酶还具备其它一些开展蛋白质工程研究的有利条件,它还是一种重要工业用酶,大量用作合成洗涤剂中降解蛋白质的组分。因此,国际上许多实验室和研究组对该酶进行了广泛的蛋白质工     

肉桂、仙灵脾对大鼠心、肾组织LDH同工酶谱变化影响初探

乳酸脱氢酶(LDH)是催化乳酸和丙酮酸代谢变化的关键酶之一。LDH同工酶由M和H两种亚基组成5种四聚体酶带,称为LDH_1～LDH_5。LDH_1(H_4)酶促乳酸成丙酮酸,进行