马铃薯卷叶病毒陕西分离物外壳蛋白(CP)的生物信息学分析

目的分析预测马铃薯卷叶病毒(PLRV)外壳蛋白的理化性质及结构。方法应用DNA-MAN软件、ExPASy中的ProtParam工具,SignalP,LipoP程序,TMHMM,PSIPRED和3D-PSSM等方法,分析PLRV.CP的核苷酸基本特征、蛋白质理化性质、亲疏水性、可溶性、信号肽、跨膜结构域、二级结构、保守区域、三级结构等。结果陕西PLRV.CP,与已报道的PLRV.CP高度同源。蛋白序列分析显示无跨膜螺旋结构,不属分泌蛋白,是可溶的亲水性蛋白。二级结构主要为折叠和无规则卷曲,不含转角。三级结构保守区预测表明,该蛋白属于黄化病毒属外壳蛋白成员。结论对马铃薯卷叶病毒外壳蛋白的生物信息学分析为进一步研究其功能、探索抗病途径奠定了基础。     

微量植物组织直接RT-PCR反应检测4种植物病毒的方法建立与优化

建立并优化微量植物组织直接RT-PCR反应检测病毒的方法:在立体显微镜下,用26 G无菌注射器针头刺入植物茎、叶柄或根中,将沾有组织液的针头直接浸入RT反应液中,通过PCR反应产生病毒特异性DNA条带.该方法在葡萄、苹果、马铃薯和百合中有效检测了葡萄卷叶相关病毒3(GLRav-3)、苹果茎沟病毒(ASGV)、马铃薯卷叶...     

马铃薯病毒一步法RT-PCR诊断研究

运用一步法RT-PCR对马铃薯和烟草中的马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒和马铃薯卷叶病毒进行了检测,实验表明:对酚-SDS方法提取的病毒核酸进行扩增,一步法RT-PCR检测到的扩增产物的灵敏度较两步法RT-PCR的高100倍左右.两种提取方法对比,用一步法RT-PCR进行扩增,检测到的PEG法扩增产物的灵敏度较酚-SDS法扩增产物的灵敏度高3倍.建立了快速、简便、灵敏度高、特异性强的马铃薯病毒一步法RT-PCR检测技术.     

微量植物组织汁液直接RT-LAMP可视化检测马铃薯卷叶病毒方法的构建

为建立快速的马铃薯卷叶病毒检测方法以应用于脱病毒后大规模样本的检测,构建利用微量植物组织汁液直接逆转录环介导恒温扩增(RT-LAMP)可视化检测马铃薯卷叶病毒的方法,即以无菌大头针的针尖刺马铃薯植株茎尖时所粘附的汁液直接作为RNA模板,采用Bacillus stearothermophilus(Bst) DNA聚合酶进行RT-LAMP扩增,扩增产物通过肉眼观察有无白色沉淀来诊断马铃薯卷叶病毒.该方法快速、操作简单、成本低,在大规模组织培养无病毒种薯生产中具有很大的应用空间.     

一种马铃薯病毒RT-PCR诊断新方法

对传统的植物病毒RNA苯酚提取法进行改进;同时设计并优化单管RT-PCR(O ne-tube RT-PCR)方法,使传统的RT-PCR两步反应在一个反应体系中同时进行,依据马铃薯Y病毒和马铃薯S病毒的基因组RNA保守序列设计2套特异性引物,采用上述新建立的检测方法对染病的马铃薯叶片组织进行病毒检测,结果与G eneB ank中报道的这两种马铃薯病毒核苷酸序列进行B last比较,同源性达到96%以上,用这种新型诊断方法对马铃薯病毒核酸进行了浓度检测,实验结果证明,这种新型马铃薯病毒诊断方法具有可靠、快速、简便等特点.     

马铃薯卷叶病毒中国株(PLRV-Ch)ORF2a基因5''''端的克隆和序列分析

用设计合成的一对特异性引物，以马铃薯卷叶病毒中国株PLRV—Ch的RNA为模板，经反转录PCR扩增，将获得ORF2a的5′端0．6kb cDNA克隆于pUC19中，构建成重组质粒pLR8．PCR检测和酶切检测表明，获得了ORF2a的5′端0．6kb cDNA克隆，从该cDNA两端进行了两次序列分析，并将获得的核苷酸序列与国外报道的4个PLRV分离株的相应区域的同源性进行了比较，5个序列间具高度同源性。     

马铃薯卷叶病毒中国株(PLRV-Ch)ORF2a基因5′端的克隆和序列分析

用设计合成的一对特异性引物,以马铃薯卷叶病毒中国株PLRV-Ch的RNA为模板,经反转录PCR扩增,将获得ORF2a的5′端0.6kbcDNA克隆于pUC19中,构建成重组质粒pLR8.PCR检测和酶切检测表明,获得了ORF2a的5′端0.6kbcDNA克隆,从该cDNA两端进行了两次序列分析,并将获得的核苷酸序列与国外报道的4个PLRV分离株的相应区域的同源性进行了比较,5个序列间具高度同源性.     

马铃薯卷叶病毒基因组保守序列片段的RT—PCR扩增

从感染马铃薯卷叶病毒的植株中提取马铃薯卷叶病毒总RNA,针对马铃薯卷叶病毒基因组,其中的2个保守序列分别设计并合成了1对寡聚核苷酸引物,用反转录-聚合酶链式反应方法从提取的病毒RNA材料中扩增出符合设计大小的240bp、400bp的特异性产物,对照的健康植株中未扩增出相应产物。     

用复制酶基因cDNA探针检测表达病毒外壳蛋白基因马…

利用马铃薯卷叶病毒（ＰＬＲＶ）复制酶基因３＇端长约６００ｂｐ的ｃＤＮＡ，用缺口平移方法进行＾３２Ｐ同位素标记，制备成ｃＤＮＡ探针，通过核酸斑点杂交，对提纯的马铃薯卷叶病毒（ＰＬＲＶ）、病毒ＲＮＡ、ＰＬＲＶ感染的马铃薯汁液，表达ＰＬＲＶ ＣＰ基因的马铃薯叶片及块茎芽进行了检测。结果表明，＾３２Ｐ标记的复制酶基因ｃＤＮＡ探针特异性强、灵敏度高。可测得提纯病毒的最低含量为４０８ｎｇ／ｍｌ，病毒ＲＮＡ最低     

大蒜病毒的快速检测

为建立一种快速便捷的检测大蒜病毒的方法,首先以4个大蒜产区的蒜种为材料采用传统的RT-PCR方法分析我国大蒜的主要病毒类型,在此基础上优化RT-PCR方法,建立大蒜病毒的快速检测方法.传统RT-PCR扩增到的序列经测序分析表明我国大蒜主要病毒类型为大蒜潜隐病毒GLV、马铃薯Y型病毒和大蒜新型病毒,通过优化RT-PCR方法、扩增模板、反应体系和循环次数,结果表明采用两步法RT-PCR方法,直接以RNA酶A处理的大蒜叶片Trizol裂解液为模板,经过40-45轮扩增循环,可以扩增到我国主要3种大蒜病毒,这为大蒜病毒的快速诊断提供技术支持.     

马铃薯卷叶病毒中国株(PLRV-Ch)ORF2a基因3′端的克隆和序列分析

用设计合成的一对特异性引物，以马铃薯卷叶病毒中国株PLRV-Ch的RNA为模板，经反转录PCR扩增，将获得的ORF2a的3′端1kb cDNA克隆于pUCl9中，构建成重组质粒pLR7，经PCR检测、酶切检测，表明获得了ORF2a的3′端1kb cDNA克隆．从两端进行了两次序列分析，将获得的核苷酸序列与国外报道的四个PLRV分离株的相应区域的同源性进行了比较．结果表明它们具有高度同源性．文中对核苷酸中存在的可能移码序列及其下游的茎环结构(或假节结构)，以及上游特征性三次重复序列进行了分析和讨论，发现上游特征性三次重复序列连续排列可形成几个连续的互补双链区和发夹结构，这一结构可能与移码有关．     

用复制酶基因cDNA探针检测表达病毒外壳蛋白基因马铃薯中的PLRV

利用马铃薯卷叶病毒（ＰＬＲＶ）复制酶基因３′端长约６００ｂｐ的ｃＤＮＡ，用缺口平移方法进行３２Ｐ同位素标记，制备成ｃＤＮＡ探针，通过核酸斑点杂交，对提纯的马铃薯卷叶病毒（ＰＬＲＶ）、病毒ＲＮＡ、ＰＬＲＶ感染的马铃薯汁液，表达ＰＬＲＶＣＰ基因的马铃薯叶片及块茎芽进行了检测．结果表明，３２Ｐ标记的复制酶基因ｃＤＮＡ探针特异性强、灵敏度高．可测得提纯病毒的最低含量为４０８ｎｇ／ｍｌ，病毒ＲＮＡ最低量为２７．８ｐｇ／ｍｌ，未转ＣＰ基因接种ＰＬＲＶ的马铃薯叶片提取液的最高稀释度为１３７５．接种ＰＬＲＶ的转ＣＰ基因的抗性马铃薯块茎芽和叶片提取液的最高稀释度为０～１／１５．此探针和只转入病毒外壳蛋白基因，不接种ＰＬＲＶ的转基因马铃薯汁液不发生反应．表明，探针只与ＰＬＲＶ基因组ＲＮＡ特异反应，而不与外壳蛋白基因及其ｍＲＮＡ反应，从而为表达ＣＰ基因的转基因马铃薯中ＰＬＲＶ的检测和抗病性鉴定建立了一种可靠的灵敏的分子生物学技术．此项技术已用于转ＣＰ基因马铃薯Ｄｅｓｉｒｅ，Ｆａｖｏｒｉｔａ，乌盟６０１和虎头的抗病性鉴定     

禽流感病毒H5HA基因在马铃薯中的表达

将编码禽流感病毒H5N1亚型HA基因(H5HA)的cDNA片段与CaMV35S启动子融合,通过农杆菌介导法转化马铃薯.分别用PCR,RT-PCR和Western斑点杂交方法对重组H5HA基因在马铃薯植株中的表达情况进行分析.实验结果表明,获得的12株转基因植株中,11株为阳性.Western斑点杂交检测表明H5HA重组蛋白已在马铃薯体内表达.这一结果将为利用马铃薯作为生物反应器生产禽流感口服疫苗提供理论依据.     

植物病毒RNA提取方法的研究

病毒RNA提取技术是分子生物学中经常应用的重要技术,是对RNA病毒在分子水平进行研究的必要手段.介绍了一种从染病植物组织中提取病毒RNA的方法,利用此方法提取了马铃薯x病毒(PVX)的RNA基因组,并通过RT-PCR得到其外壳蛋白基因,提取的病毒RNA在纯度和产量上都可满足反转录和PCR扩增等基本分子生物学操作.     

大熊猫粪便样品中犬瘟热病毒的检测

根据GenBank中登录的犬瘟热病毒(CDV)N基因序列,设计合成1对特异性引物,以犬瘟热病毒疫苗中提取的RNA为阳性模板建立了快速检测CDV的RT-PCR方法,结果显示,所建立的CDV RT-PCR扩增得到与理论设计值大小一致的456 bp的特异性片段,对犬细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、牛轮状病毒(BRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、大肠杆菌(E.coli)和新城疫病毒(NDV)的扩增结果均为阴性;最低可检出约1.53×10~2拷贝/μL的核酸;重复性试验结果表明,该方法检测重复性好.此方法对成都大熊猫繁育研究基地的37份眼观正常的大熊猫粪便样品检测,未检测出犬瘟热病毒,与胶体金试纸卡检测结果一致.     

深州蜜桃果实中的病毒和类病毒检测

为了确定侵染深州蜜桃的病毒和类病毒种类,利用RT-PCR和qRT-PCR的方法对侵染桃树的7种病毒和类病毒进行了检测。RT-PCR病毒鉴定结果表明,深州蜜桃感染了苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)、李树皮坏死茎纹孔伴随病毒(PBNSPa V)、李属坏死环斑病毒(PNRSV)和啤酒花矮化类病毒(HSVd),在深州蜜桃果实中没有鉴定到李矮缩病毒(PDV)、樱桃绿环斑驳病毒(CGRMV)、杏假褪绿叶斑病毒(APCLSV)。qRT-PCR检测结果进一步表明李属坏死环斑病毒(PNRSV)侵染了深州蜜桃,其病毒RNA表达量最低。利用RT-PCR开发出高效的多重检测体系,能够同时检测ACLSV,PBNSPa V和HSVd病毒。     

常规RT-PCR快速检测诺如病毒方法的建立

目的建立一种可同时检测GⅠ、GⅡ型诺如病毒(Norovirus,NOV)的常规RT-PCR方法.方法针对GⅠ、GⅡ型诺如病毒RdRp区域的基因进行引物设计,优化PCR反应体系及条件,评价该方法的灵敏度、特异度.结果该引物对诺如病毒的特异度强,同一体系内的GⅠ、GⅡ型诺如病毒相互之间无干扰,与轮状病毒、星状病毒、肠道腺病毒、甲型肝炎病毒同时检测无交叉反应;对GⅠ、GⅡ型诺如病毒核酸的最低检测限值是10~3拷贝/μL.结论本研究建立常规RT-PCR检测方法对GⅠ、GⅡ型诺如病毒进行快速检测,具有很好的灵敏度和特异性.     

PAS-ELISA检测GFLV和GLRaV-3技术的研究

以中国农业科学院郑州果树研究所国家葡萄资源圃的葡萄品种为试材,对葡萄扇叶病毒(GFLV)和葡萄卷叶相关病毒Ⅲ(GLRaV-3)进行了A蛋白酶联免疫吸附测定(PAS-ELISA)的检测技术的研究.从阴、阳性对照及抗血清或抗体浓度的选择,到不同时期、检测部位对结果的影响,建立了一套完整的ELISA检测GFLV和GLRaV-3程序;通过实验分析,该方法快速,简便,经济且灵敏度高,不失为葡萄病毒检测的一种新方法.通过检测,还了解到了GFLV的发病高峰在春季,主要发病部位在上部叶片,而GLRaV-3的发病高峰在秋季,重要发病部位在下部叶片.为葡萄病毒的综合防治打下良好的基础.     

针对马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链的突变核酶的克隆及体外转录

根据特异性切割马铃薯卷叶病毒中国分离株 ( PLRV-Ch)复制酶基因负链 RNA的锤头状核酶 ,设计、合成了编码与其相应的突变核酶的 c DNA,并克隆到质粒 p GEM-4 Z中 ,经序列分析及体外转录表明得到完整的突变核酶基因重组质粒 ,从而为突变核酶的转基因及进一步研究核酶在转基因马铃薯中表达引起的抗性及机理创造了条件     

应用乳胶凝聚试验诊断马铃薯X、Y病毒的研究

将提纯的免疫球蛋白、特异性抗血清或抗原吸附在均一的乳胶颗粒表面,当和相应的抗原或抗体反应时,乳胶颗粒便发生凝聚,借以提高血清反应的灵敏度。Singer和Plotz(1956)最早应用这一方法。据报导,曾应用乳胶凝聚试验研究大麦黄矮病毒(BYDV)、南芥菜花叶病毒(AMV)、蕃茄黑环病毒(TBRV)、烟草脆裂病毒(TRV)、马铃薯X、Y、S、A和奥古巴花叶病毒等植物病毒。秘鲁国际马铃薯研究中心从1977年8月份开始,采用乳胶凝聚试验鉴定马铃薯X、Y、S病毒、安第斯马铃薯隐潜病毒和安第斯马铃薯斑驳病毒。国内在医学上曾采用乳胶凝聚的方法进行某些疾病的诊断。但应用这一方法鉴定