从五十种药用植物筛选胰蛋白酶抑制剂

胰蛋白酶抑制剂的生理作用,除保护生物体的一些组织不被胰蛋白酶水解外,对生物的受精~(1)、胚胎的发育~(2)、血液的凝固及抗凝固~(3)都有密切的关系。近年来已发表了胰蛋白酶抑制剂对多种疾病的影响~(4)及其在动物实验和临床治疗研究方面的综合报导~(5)。胰蛋白酶抑制剂作为药物应用有着广阔的前景。目前,对来源于动物的胰蛋白酶抑制剂的研究比植物的多且详细,但其含量极微。植物来源的胰蛋白酶抑制剂的研究也多限于豆科植物的种子。中国医药学是一个伟大的宝库,中草药的种类繁多、来源丰富。本研究的目的是从中草药筛选和提取胰蛋白酶抑制剂,研究其理化性质及生理活性,从而说明其药理作用。本文报导了从五十种药用植物筛选出入种含有胰蛋白酶抑制剂的物质,为今后的进一步研究打下基础。     

人胰蛋白酶原-2在大肠杆菌中的表达、纯化与活性测定

胰蛋白酶原-2是急性胰腺炎相关的敏感而特异的标志物,并且与多种肿瘤转移的过程密切相关．对胰蛋白酶原-2基因5’端4个氨基酸的密码子碱基进行简并突变,并在其3’端连接6个组氨酸编码序列构建含重组质粒pBVTg2的大肠杆菌工程菌-pBvTg2／DH5α．重组大肠杆菌经温度诱导后获得了高效表达,重组蛋白占总菌体蛋白的20％,并以包涵体形式存在．包涵体经尿素缓冲液裂解后,通过Ni-NTA亲和树脂一步分离纯化．纯化蛋白经SDS-PAGE分析及利用anti—histidine mAb进行Western blotting分析,以及蛋白N末端测序分析,结果表明与目的蛋白特征相符合．纯化的重组人胰蛋白酶原-2经复性后能与天然人胰蛋白酶原-2的单抗antihTrypsinogen2 mAb特异结合,复性后的蛋白在肠激酶作用后测得具有74BAEEU／mg的胰蛋白酶比活力,为进行胰蛋白酶原-2单克隆抗体的制备及其检测和应用奠定了基础．     

液相色谱-高分辨串联质谱法检测牛奶中A1和A2β-酪蛋白

建立一种基于液相色谱-高分辨串联质谱(LC-HRMS/MS)方法检测牛奶中A1和A2β-酪蛋白.采用等电点沉淀法从牛奶中提取酪蛋白,经胰蛋白酶酶解后,将酶解产物进行LC-HRMS/MS分析,选择含有差异氨基酸残基(第67位)的肽段作为特征肽段对A1和A2β-酪蛋白进行区分.采用Tris-HCl缓冲溶液充分溶解酪蛋白,在...     

硫酯蛋白家族保守区域分析

硫酯蛋白家族(thioester-containing proteins,TEPs)广泛分布于动物界,在动物非特异性免疫反应中发挥了重要的作用,然而其家族成员多,分子进化关系复杂.本研究从基因数据库中挑取已收录TEPs家族各成员的氨基酸全序列,包括α2-巨球蛋白、补体3、补体4、murinoglobulins、卵巨球蛋白、妊娠区带蛋白,α-1-抑制因子等.多重序列比对分析TEPs家族各成员间功能位点和保守区域的变化,构建系统进化树分析TEPs家族分子进化.TEPs家族除保守的GC*EQ**硫酯键区域及两侧的脯氨酸残基,还有7个完全保守的氨基酸残基及G*****Q*T,FPETW,QTD,KPTVK等保守区域.上述分析结果可为深入研究TEPs家族分子进化及动物非特异性免疫进化提供参考.     

人金属硫蛋白-3的α结构域的表达及其性质研究

参考E.coli偏爱密码子,设计并合成人MT-3α结构域(α-MT-3)的DNA片段,克隆到表达载体pGEX-4T-1中。经IPTG诱导,在E.coli中高效表达出谷胱甘肽-S-转移酶(GST)-α融合蛋白。凝血酶酶切融合蛋白(用CdCl₂或ZnSO₄辅助)后,得到纯化的结合镉或锌的α-MT-3蛋白。质谱分子量检测及氨基酸组成分析证明得到了目的蛋白。紫外吸收光谱及圆二色性光谱研究重组α-MT-3的结构。MT-3的与其余MT的α结构域不同,α-MT-3的圆二色性光谱在220nm左右为负峰,说明α-MT-3可能包含一个α-螺旋的二级结构。     

重组刺桐胰蛋白酶抑制剂的制备及活性鉴定

刺桐胰蛋白酶抑制剂(ETI)是一种Kunitz型胰蛋白酶抑制剂,能够抑制胰蛋白酶及组织型纤溶酶原激活剂的活性,因此ETI可以作为配体与固定相偶联用于亲和层析.利用化学合成及聚合酶链式反应(PCR)的方法获得ETI的编码基因,然后用NdeI/SacI酶切并插入载体pET25b ( )中构建重组表达质粒pET25b ( )/ETI .重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用IPTG诱导使重组ETI(rETI)过量表达形成包涵体.包涵体经过洗涤、复性及CM离子交换柱纯化,每升培养液可获得14 mgrETI ,其纯度超过92 %.活性测定表明,rETI对凝血酶及尿激酶的活性没有抑制作用,但能显著抑制胰蛋白酶、瑞替普酶及纤溶酶的活性,抑制常数Ki分别为5 .14×10-9,9 .4×10-8和2 .08×10-8mol/L.     

猪血浆α_1—抗胰蛋白酶的紫外光谱和园二色谱

本文报告了对猪血浆α_1抗胰蛋白酶的紫外吸收光谱和园二色谱的测定结果。从紫外光谱分析得知猪α_1抗胰蛋白酶表现出典型的蛋白质吸收特征,其摩尔消光系数E_(280nm)~1％1cm 等于5.25;从(?)二色谱分析得知该蛋白质分子中合有约8％的α螺旋,50％的β-折叠,其余均为无规则卷曲构象。本测定结果对猪α_1-抗胰蛋白酶的性质、结构和功能的研究打下了基础。     

谷氨酰胺对体外循环后肺上皮屏障功能保护机制的探讨

[目的]观察不同剂量谷氨酰胺对对体外循环期间肺泡通透性、氧化酶及炎症因子水平及AQP蛋白表达的影响,并探讨其保护机制.[方法]大鼠体外循环的建立,Wistar大鼠32只随机分为假手术对照组(Sham-operatedgroup,SH)、体外循环组(cardiopulmonary bypass group,CPB)提取肺组织及血液中各时相炎性介质、过氧化酶及AQP表达.[结果]CPB组各时相点EVLW、MDA、MPO、血浆TNF-α、IL-6浓度均明显升高,AQP-1呈现低表达,AQP-4呈现高表达;SOD、IL-10浓度明显降低,谷氨酰胺组则呈现相反变化,停CPB 2h后表现更加明显,两组差异有统计学意义.[结论]Gln预处理可以使AQP-1蛋白和mRNA表达增加,AQP-4蛋白和mRNA表达下降,降低肺组织MDA、MPO和血浆LPS、TNF-α、IL-6和MMP-9含量,增加肺组织SOD和血浆IL-10含量,提示Gln可能通过抗氧化损伤、调节炎症反应,减轻CPB后细菌易位引起的内毒素血症,间接调控MMP-9的表达及活性等途径实现,对肺上皮屏障起到一定的保护作用.     

鲎血淋巴系统的特点及其功能

鲎的血淋巴系统由心脏、血管和血淋巴液组成．心脏和血管系统非常发达，而且血液量巨大．血淋巴液由血浆和血细胞组成．血浆主要含有血蓝蛋白、02—巨球蛋白、C—反应蛋白等．对鲎血细胞的种类，看法不一，其主要的血细胞类型为颗粒性血细胞，其胞质中含有特征性的大小颗粒．鲎的血淋巴中含有50种以上的免疫因子，大都位于大小颗粒中，它们在鲎的天然免疫中起重要的作用．     

补骨脂胰蛋白酶抑制剂的提取及其特征

前文~(1)我们报道了从五十种中草药中筛选出补骨脂、黑豇豆、天花粉等八种含有胰蛋白酶抑制剂的活性植物物质。本文报道补骨脂胰蛋白酶抑制剂的分离纯化及其一些特性。材料和方法(一)实验材料及其预处理1.补骨脂购自省医药采购供应站。将补骨脂装入索氏提取器,用氯仿抽提六小时,风干后粉碎,经80目筛筛分备用。2.胰蛋白酶新疆伊犁地区肉联厂生化制药厂产品。3.羊胰蛋白酶结晶品。上海生化所东风试剂厂产品。(二)底物及试剂     

中医证候的多元统计分析及方法研究

从"高脂血症及动脉粥样硬化痰瘀证候的蛋白质组学研究"的数据出发,研究影响中医证候的各主要因素。对11种可能的标志蛋白质(群)数据进行分析,以统计聚类为主导思想,给出变量聚类和样本数据聚类综合应用的方法,并结合医学角度对变量聚类结果的分析,指导组内和组间两种样本聚类讨论;同时,通过假设检验,从统计理论上对所得分类予以支持。最后得到标志蛋白质群{结合珠蛋白前体,α-胰蛋白酶抑制剂轻链,脂肪细胞脂质结合蛋白异构体3,补体C4}或{纤维蛋白原γ链,α-胰蛋白酶抑制剂轻链,未确定名称的蛋白(ID1485)}。考虑可能是区分高脂血症及动脉粥样硬化痰证和瘀证的标志蛋白质群,从而给出蛋白质水平上对痰证和瘀证判决方法的建议。     

香茶菜属植物中的三萜化合物对脂质过氧化和DNA损伤的保护作用

通过检测对H2O2处理的人外周血单个核细胞的DNA损伤、鼠肝微粒体脂质过氧化和pBR322 DNA氧化断裂的保护作用,测定了从香茶菜中提取到的4种三萜化合物的抗氧化活性.结果表明,4种化合物在这3种体系中发挥着不同的作用.熊果酸在所有体系中保护作用最强;2α,3β-二羟基-乌苏-12-烯-28-酸在抑制脂质过氧化时活性强,而在抑制单链DNA断裂中作用较弱;其异构体2α,3α-二羟基-乌苏-12-烯-28-酸作用正好相反;齐墩果酸仅在在H2O2处理的单个核细胞层DNA损伤中具有微弱保护作用.     

萨尔瓦多型银合欢种子胰蛋白酶抑制剂的分离纯化与性质研究

本研究从萨尔瓦多型银合欢(Leucaena leucocephala cv.Salvador)种子中分离纯化出一种新的胰蛋白酶抑制剂,即萨尔瓦多型银合欢种子胰蛋白抑制剂(Trypsin Inhibitor from Leucaena leucocephala cv.Salvador seeds,LlsTI).成熟的种子经粉碎,生理盐水浸提之后,经CM-Sepharose阳离子交换层析得到LlsTI纯品.该胰蛋白抑制剂为19.8kDa的单体蛋白.其N末端测序结果为KGSYLRDVRG,而其内部则含有一段KTAPLVVGFLK的序列,与已知的蛋白酶抑制剂序列都不同,表明LlsTI为一种新的胰蛋白酶抑制剂,同时也含有一部分与已知Kunitz型抑制剂相保守的碱基.LlsTI对胰蛋白酶的摩尔抑制比近似为1∶1.其对于胰蛋白酶属竞争性抑制剂,其Ki值为2.77×10-10 M.LlsTI对胰蛋白酶的抑制活力表现出对高温和pH变化较高的耐受性.但其活性受100mM DTT影响.本研究对LlsTI对其它丝氨酸类蛋白酶的抑制作用也做了测定,其中只有胰蛋白酶的活性受到了抑制.根据圆二色谱的分析结果,LlsTI是一种αβ蛋白,其二级结构在室温下的水和缓冲液Tris-HCl(pH7.5)中组成相似.     

猪血浆巯基蛋白酶抑制剂的分离纯化及性质研究

用(NH_4)_2SO_4分段盐析,DEAE-纤维素离子交换和Papain—Sepharose亲和层析,从猪血浆纯化了一种巯基蛋白酶抑制剂(SUlfhydryl proteinase inhibitor;简称SPI);纯化倍数为54.36倍.经高pH、低PH不连续电泳呈一条区带.含糖量为7.77％;PI为4.80.氨基酸组成分析表明,猪血SPI富含酸性氨基酸、芳香族氨基酸和含硫氨基酸.用SDS-PAGE和SephadexG-100层析,测得分子量为130000d和131000d,由两个分子量略有差别的亚基组成.对木瓜蛋白酶有强烈抑制作用,对胰蛋白酶无作用。α-螺旋结构含量高。     

一步法合成α-羟基环己基苯基甲酮的研究

采用α-羧基环己基磺酸为原料一步合成α-羟基环己基苯基甲酮.α-羧基环己基磺酸来源于巴陵石化甲苯法制己内酰胺的608废液中磺化副产物的提取.实验研究表明:以"沉淀还原法"与"络合萃取法"相结合从608废液中提取α-羧基环己基磺酸,其收率为85.7%,纯度达95%;一步法反应过程存在最佳原料配比m(α-羧基环己基磺酸二钠):m(苯甲酸)=2.2∶2.44,MnO作为催化剂,在反应温度为330℃,反应时间为2 h,催化剂浓度为0.99wt%下,α-羟基环己基苯基甲酮的收率达到70.4%,纯度为80.5%.     

具有抑制糖苷酶和胰蛋白酶双重活性的亚麻多肽的大肠杆菌重组表达及其活性分析

亚麻胰蛋白酶抑制剂(Linum usitatissimum L.LUTI)是亚麻中一种兼具胰蛋白酶抑制剂和α-葡萄糖苷酶抑制剂双重活性的多肽。文章将LUTI基因连接在pGEX-6p-1载体上获得重组载体pGEX-6p-1-LUTI,转化至大肠杆菌菌株E.coliBL21(DE3)表达,经GST-Sepharose4B、Prescission Protease酶切GST标签、Sephacryl S-200凝胶层析,获得分子量大小为8kDa电泳纯的重组LUTI(rLUTI)。经抑制活性测定,相比天然的LUTI,rLUTI对胰蛋白酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性明显提升。二硫键存在与否对两种酶的抑制活力均有影响。利用定点突变技术获得rLUTI的C4/A,C49/A,C4、49/A突变体,进一步双酶抑制活性及CD结构分析显示,rLUTI的C4/A、C49/A及C4、49/A突变体对胰蛋白酶抑制活性影响尤为明显,α-葡萄糖苷酶的抑制活性略微下降;其中rLUTI的C49/A及C4、49/A突变体完全丧失了对胰蛋白酶的抑制活性。C4/A的突变对rLUTI的二级结构影响最为明显,导致α螺旋结构含量的降低。以上结果表明rLUTI第4位氨基酸Cys是影响其二级结构的关键位点,第49位氨基酸Cys则在维持其双酶抑制活性上发挥着重要作用,特别在胰蛋白抑制活性方面尤为突出。     

动态光谱法用于人体血液中多种蛋白含量的无创测量

无创血液成分测量作为一种急需的医疗检验技术具有十分重要的临床应用价值,由于未能消除个体差异和测量环境等因素的影响,该技术难以进入临床应用领域.动态光谱法从理论上解决了上述问题.基于动态光谱理论首次尝试对人体血液中多种蛋白含量的无创测量,采集110名志愿者指端透射光谱信息,并以血液成分含量生化分析值为参考,建立血液中多种蛋白含量与动态光谱数据的偏最小二乘法(PLS)校正模型.对血红蛋白、总蛋白和白蛋白含量校正模型的相关系数分别为0.999 4、0.922 1和0.956 0,预测集的平均相对误差为3.77%、3.49%和3.40%.结果表明,应用动态光谱对血液蛋白含量进行无创测量的方法可获得较高的精度,也为近红外光谱法对血液成分的无创测量提供了一条新的路径.     

人工栽培南方红豆杉紫杉烷成分的研究

采用溶剂萃取及多种色谱技术分离纯化,从人工栽培南方红豆杉中分离得到紫杉醇(Ⅰ)、2′-乙酰氧基-7-表-紫杉醇(Ⅱ)、(3E,7E)-2,α10,β13α-三乙酰基-5,α20-二羟基-3,8-断紫杉烷-3,7,11-三烯-9-酮(Ⅲ)和7-表-紫杉醇(Ⅳ),其中化合物(Ⅱ)首次从南方红豆杉分离得到。     

ASICs阻断剂对大鼠脑I/R损伤炎性反应的影响

探讨了酸敏感离子通道阻断剂阿米洛利对大鼠脑I/R损伤性炎性反应的影响。采用Zea Longa线栓法建立Sprague-Dawley(SD)大鼠局灶性脑缺血再灌注(I/R)模型,于脑缺血2h再灌注24h时间点测定血清肿瘤坏死因子-α和血浆内皮素的含量。结果显示各组间比较差异有统计学意义:血清肿瘤坏死因子-α:F=9.937,P=0.000;血浆内皮素:F=49.487,P=0.000;阿米洛剂Ⅰ组和Ⅱ组的血清肿瘤坏死因子-α和血浆内皮素较相应I/R模型组低(P<0.05)。这表明,阿米洛利可能通过阻断酸敏感离子通道减轻Ca2超载,降低肿瘤坏死因子-α和血浆内皮素的含量而抑制炎性反应,发挥神经保护作用。     

大黄三种有效成分对胰蛋白酶活性及结构的影响

大黄素、大黄酸、大黄酚对胰蛋白酶活性均有一定程度的抑制作用.当有效成分浓度为2.5 mg·L~(-1)时,长濑法测定表明它们对胰蛋白酶的抑制率分别为38.0%、48.2%及35.4%.紫外吸收光谱、荧光光谱和圆二色谱研究表明三种有效成分影响胰蛋白酶酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸残基的微环境,改变了胰蛋白酶结构.圆二色谱计算发现,大黄素、大黄酸、大黄酚分别使胰蛋白酶二级结构中口α-螺旋含量减少了2.8%、3.2%和2.5%,β-折叠含量增加了1.6%、2.O%和1.4%.