食管癌相关基因2(ECRG2)包涵体的溶解与纯化

采用生物工程的手段,用插有食管癌相关基因2(ECRG2)开放阅读框(ORF)的原核表达质粒pEGX-4T-1转化大肠杆菌E.coli,诱导表达了重组的GST-ECRG2融合蛋白;收集GST-ECRG2融合蛋白包涵体,经SKL溶解后在PBS中透析复性,用GST亲和层析柱纯化,从而获得一定数量的高纯度重组ECRG2蛋白.     

人细胞周期蛋白D1在大肠杆菌BL21中的表达及纯化

将人细胞周期蛋白D1全长cDNA克隆入原核表达载体pET-28c(+)中, 经酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)后获得表达菌株. 该菌株经IPTG诱导高效表达出带有组氨酸标签的以包涵体形式存在的融合蛋白, 表达量占菌体总蛋白的23%. 包涵体经洗涤和溶解， 在变性条件下利用Ni²⁺螯合柱纯化、 尿素梯度复性后， 得到纯度达98%以上的纯化蛋白. SDS-PAGE显示纯化蛋白的分子量约为43 ０００， Western-b lot分析表明， 在相应分子量处有一特异性条带， 说明成功表达和纯化重组人细胞周期蛋白D1.     

人CDK4基因的原核表达及重组蛋白的纯化和复性

将人CDK4基因克隆入原核表达载体pET28a（+）中, 经 酶切和测序鉴定正确的重组质粒pET28a-CDK4, 转化E.coliBL21(DE3)后获得表达菌株. 该表达菌株经IPTG诱导后, 高效表达出带有组氨酸标签的以包涵体形式存在的融合蛋白, 表达量占菌体总蛋白的52.6%, 包涵体经过洗涤、 尿素变性溶解、 His Trap HP Kit柱纯化、 稀释复性, 获得纯度达98%以上的蛋白. SDS-PAGE及Western blot分析表明, 在分子量34 000处有一特异性蛋白条带. 结果表明, 已成功的表达和纯化纯度达98%的重组人CDK4蛋白.     

融合型乳酸片球菌素在大肠杆菌中的表达与纯化

为在大肠杆菌中高效表达乳酸片球菌素(PED),按照美国国立生物技术信息中心公布的PED基因序列设计合成引物,以乳酸片球菌基因组DNA为模板,用多聚酶链式反应扩增PED结构基因特异片段,构建编码组氨酸标记硫氧还原蛋白融合PED的重组表达质粒pET32c-PED,并转化大肠杆菌BL21(DE3).在异丙基硫代半乳糖苷诱导后融合蛋白以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的28%.经镍亲合层析纯化的融合蛋白用肠激酶裂解,再经超滤纯化,可得78%的收率.融合蛋白没有抗粪肠球菌细菌素活性,被分开的PED恢复了抑菌活性.     

铜绿假单胞菌的LexA蛋白在大肠杆菌中的高效表达与纯化

目的:对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)的阻遏蛋白LexA进行基因克隆、重组表达及蛋白纯化.方法:采用PCR法从PAO1株基因组中扩增出1 086 bp的LexA基因,将此基因片段插入到表达载体pET32a( )上,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.包涵体洗涤后用8 mol/L尿素溶解,以镍离子亲合柱层析作为第1步纯化,Superdex75凝胶过滤层析作为第2步精细纯化,反相高相液相色谱法(HPLC)测定蛋白的浓度.结果:LexA以包涵体形式表达,表达量为45%,经镍离子亲合柱层析纯化后LexA蛋白纯度达到85%以上,回收率大于80%,镍离子亲合柱层析和凝胶过滤层析两步纯化目的蛋白,经HPLC测定,最终目的蛋白的纯度为98.97%.结论:在pET32a( )表达系统中实现了PA的LexA蛋白的高效表达,两步纯化法获得高纯度的目的蛋白,为进一步鉴定LexA靶位点奠定了基础.     

重组嵌合生长抑素工程菌的构建、表达与免疫

将动物生长抑素(SS)与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)融合基因插入p ET28a系统,构建重组质粒pET28a-A4030-2-LTB并转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态中,获得了大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)p ET28a-A4030-2-LTB,然后使用SDS-PAGE检测该融合蛋白的表达并优化其发酵与包涵体洗涤条件,接着采用亲和层析法进行纯化,并用Western Blotting技术检测该融合蛋白的免疫原性.研究结果表明,在37℃,加入1 mmol/L的IPTG培养3 h后,融合蛋白的表达量最高且稳定表达;在包涵体洗涤的过程中,使用含有φ=1%的Triton X-100、2 mol/L尿素和0.5 mol/L NaCl的缓冲液洗涤包涵体沉淀,其效果最佳,用Western Blotting方法检测出该蛋白能发生抗原抗体反应,并且将重组蛋白免疫7只小鼠后,其中有6只小鼠产生了抗SS抗体,表达产物具有免疫原性.此研究为进一步开发生长抑素基因工程疫苗提供了可靠的实验依据.     

重组人瘦素蛋白的原核表达、纯化和生物学活性鉴定

为解决重组人瘦素蛋白(hLeptin)大规模生产过程中包涵体的形成以及体外重折叠过程中蛋白聚集导致的低产量,探究在大肠杆菌中hLeptin高水平可溶性的表达,并进行生物学活性检测.利用hLeptin成熟肽基因与pET-30a(+)-SUMO系统构建融合表达质粒pET-30a(+)-SUMO-Lep,转化至大肠杆菌BL21(DE3),加入异丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)进行诱导表达,之后经Ni金属亲和层析纯化,并切去SUMO融合标签后获得成熟hLeptin.重组hLeptin表达量高,主要以可溶形式存在.通过KM小鼠减肥实验和CCK8实验证明重组hLeptin具有生物学活性.综上,使用SUMO融合标签,以增强hLeptin在大肠杆菌中的高效可溶性高纯度的表达,为大规模生产hLeptin提供了一种新方法,同时为表达可溶性重组蛋白研究提供了一定的基础.     

重组人干扰素α2b和胸腺肽αl融合蛋白的分离纯化

考察了大肠杆菌E.coli表达的重组人干扰素α2b和胸腺肽αl融合蛋白包涵体的变性、复性及融合蛋白的分离纯化过程。实验结果表明：包涵体经7mol/L盐酸胍,10mmol/L DTT变性;1mol/L尿素,2mmol/L还原型谷胱甘肽,0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽脉冲加样稀释复性;金属螯合层析收集0.3mol/L咪唑洗脱峰,冷干后经重组肠激酶30℃酶切24h、Sephadex G50 柱纯化,可得到纯度达90%的重组人干扰素α2b和胸腺肽αl融合蛋白,且最终目的融合蛋白产量达68mg/g干菌体。     

胡萝卜抗冻蛋白在大肠杆菌中的高效表达

以pET—11a为载体构建了胡萝卜抗冻蛋白非融合表达的重组质粒，并在大肠杆菌菌株BL21(DE3，pLysS)中成功地进行了高效表达。表达的蛋白质以包涵体的形式存在，相对分子质量为36800。经正交试验得到了优化的诱导表达条件。包涵体经各种缓冲液洗涤纯化、溶解、复性和超滤浓缩后，经SDS—PAGE电泳检测，纯度达单一带水平。生物学活性研究表明，重组表达的胡萝卜抗冻蛋白具有很强的热滞活性和提高细菌耐寒性的作用。     

重组人DNaseⅠ不同表达模式的下游工艺研究

研究了诱导温度对重组人DNaseⅠ(rhDNaseⅠ)在大肠杆菌中可溶表达的影响,发现加诱导剂后在37℃培养时,rhDNaseⅠ融合蛋白以包涵体形式存在;而20℃培养,rhDNaseⅠ融合蛋白有62.3%分泌到周质,并且具有酶活性。对这两种不同表达模式表达的rhDNaseⅠ融合蛋白进行分离纯化,发现前者最终酶活为592.2 U/mg,回收率为32.1%;后者酶活为1283U/mg,回收率为24.1%。比较这两种纯化工艺,分泌表达模式的分离纯化工艺较好。     

Lrrc10蛋白表达载体的构建

为了构建重组质粒pET-Lrrc10和Lrrc10蛋白表达,利用Nco Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切载体pMD18-T-Lrrc10,回收目的片段与经同样酶切后的表达载体pET-30a(+),转入E.coli strainDH5α,菌落PCR筛选阳性菌落,提取阳性菌质粒并进行PCR和酶切鉴定;将重组子转入E.coli strain BL21(DE3),于37℃振荡培养,用1 mmol/L IPTG诱导目的蛋白的表达。结果表明,成功构建了融合表达载体并命名为pET-Lrrc10。转入E.coli strain BL21(DE3)进行目的蛋白的表达,获得与预期分子量大小相一致的融合表达蛋白Lrrc10;Lrrc10蛋白以包涵体形式存在于宿主菌中,且IPTG诱导4小时,目的蛋白表达量最大。     

SARS冠状病毒N蛋白的表达及二级结构预测分析

通过RT-PCR获得SARS冠状病毒N蛋白基因，分别克隆到原核表达载体pET21a，pET32a和pGEX-4T-1中，将3种重组质粒pET2la-N，pET32a-N和pGEX-4T-1-N分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导，细菌中分别表达出约46kD的重组N蛋白、约60kD的6xHis-N融合蛋白和约70kD的GST-N融合蛋白，表达量分别达总蛋白的45％、40％和30％．进一步的分析表明：6xHis-N融合蛋白在大肠杆菌中为可溶性表达，该可溶性组分占细菌裂解液的70％左右，且能被6xHis抗体所识别．用蛋白分析软件对N蛋白进行了序列分析和二级结构预测．SARS冠状病毒N蛋白在大肠杆菌中的高效可溶性表达，有助于进一步结晶后进行X射线晶体衍射分析其结构与功能．     

人纤溶酶原K1—3区基因在大肠杆菌中的表达

将人纤溶酶原Krigle 1-3(K1-3)基因插入融合表达载体pET-17b，获得重组质粒pET-K13,转化E.coli BI21(DE3),在IPTG诱导下，人纤溶酶原K1－3基因在E.coli BI21(DE3,pET-K13)中获得高效融合表达，表达量占菌体总蛋白的24％，表达产物以包函体存在，Western blot证明重组 蛋白对人纤溶酶原抗血清有特异免疫原性。     

GST-hBLyS融合蛋白基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

根据hBLyS (humanBlymphocytestimulator)基因序列设计合成特异性引物 ,用RT_PCR从人外周血淋巴细胞扩增出 85 8bp的hBLyS基因 ,并将其插入到融合蛋白原核表达载体 pGEX_4T_1中 ,得到重组表达质粒pGEX_4T_1/hBLyS。把此重组质粒转化大肠杆菌BL2 1,经用IPTG诱导 ,表达出了GST_hBLyS融合蛋白。     

大鼠肌肉素cDNA克隆及表达

通过RT-PCR方法从大鼠骨骼肌中克隆到肌肉素cDNA,构建表达载体pGEX-5X-3-musclin,并在BL21大肠杆菌中成功表达了融合蛋白GST-Musclin,且对表达条件进行了优化.在最优化的表达条件下,融合蛋白的表达量达到了14.2%.     

人胰岛素原基因在大肠杆菌中的表达和纯化

将人胰岛素原基因序列(human proinsulin, PI)经密码子优化后与TrxA蛋白融合表达,构建原核表达载体TrxA-PI转入不同大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)、TransB(DE3)和Rosetta-gami(DE3)中。SDS-PAGE显示融合蛋白在3种表达菌株中均有表达,在Rosetta-gami(DE3)中表达量最高,是普通大肠杆菌BL21(DE3)表达量的10倍。通过优化诱导温度等发酵条件,可溶性重组融合蛋白TrxA-PI在Rosetta-gami(DE3)菌株中表达量为3.5 g/L,比未优化时提高约10倍。TrxA-PI用肠激酶酶切后,利用HisTrap FF柱分离纯化PI,经Western-blot检测重组PI具有免疫原性。     

褐藻胶裂解酶基因的克隆、表达载体构建以及表达条件的研究

以产褐藻胶裂解酶的紫色链霉菌(Streptomyces violaceoruber)为出发菌株,应用基因工程技术,将褐藻胶裂解酶aly基因进行克隆,并构建了该基因的重组表达载体pET23b(+)-aly.通过表达条件的初步优化,实现了aly基因在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中的成功表达.在IPTG诱导浓度为0.1mmol/L,诱导时间为8h,诱导温度为16℃的条件下,细胞破壁后上清中ALY粗酶液活力为6U/mg.根据褐藻胶裂解酶ALY的蛋白质结构预测结果推断该酶属于Algi-nate lyase-2家族,理论pI为8.85,理论分子量大小为28 500,化学式为C1252N1920H356O394S9.SDS-PAGE蛋白电泳检测发现,ALY蛋白的分子量约为28 000,与预测的蛋白分子量较为接近.     

鱼腥藻铁吸收调节蛋白基因(alr0957)的克隆和表达

依据CyanoBase提供的鱼腥藻PCC7120 furC基因(alr0957)的序列信息设计了一对特异性引物,用Touch-down PCR的方法从基因组DNA中扩增得到大小约450bp的目的片段.通过TA克隆的方法将该片段连接到pMD18-T载体上筛选出重组质粒pMD18-T-fur,然后进行双酶切,纯化furC基因,再连接到原核表达载体pET-28a(+)上,转化表达菌株BL21(DE3).经PCR、双酶切和测序鉴定,对阳性菌株进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测重组蛋白.结果表明:在25℃条件下经1mmol/L IPTG诱导20h,融合蛋白被成功表达,其分子量约为19 000,为进一步纯化蛋白和对基因的调控功能方面研究奠定了基础.     

人血管生成素基因的克隆及表达

利用RI-PCR方法从培养的人黑色素瘤细胞系A375中扩增得到了人血管生成素cDNA片段,测序正确后克隆入表达载体pET-28a( )中并转化于E.coli BL21宿主菌中.经IPTG诱导,表达了N端融合6个组氨酸标签(6His-tag)的血管生成素融合蛋白.利用6His-tag与过渡态金属离子Ni2 高亲和力结合的性质,经镍柱纯化,获得了高纯度的血管生成素融合蛋白,为进一步研究其生物活性及应用奠定了基础.