RACK1蛋白在毕赤酵母GS115中的表达研究

本文克隆得到了拟南芥和水稻的活化态C激酶1受体基因,AtRACK1/OsRACK1,用电转化的方法成功将AtRACK1/OsRACK1基因整合到毕赤酵母GS115的染色体上,经菌体培养和甲醇诱导后获得了有效分泌表达,表达产物存在于培养液上清中,表达蛋白经SDS-PAGE鉴定显示其分子量为36kD左右,在诱导72小时后AtRACK1/OsRACK1蛋白表达量最大,该结果为进一步纯化RACK1蛋白,获得植物RACK1蛋白抗体奠定了基础.     

抗人端粒酶逆转录酶单链抗体基因在烟草中的表达

构建了含抗人端粒酶逆转录酶单链抗体基因ScFv-hTERT的植物表达载体p1304-SH,通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草.转基因烟草植株叶片总DNA的PCR,Southern b lot检测结果表明,ScFv-hTERT基因已整合进了转基因烟草植株基因组中;RT-PCR,SDS-PAGE分析证实目的基因已在烟草叶片中成功表达,竞争性ELISA的结果表明,表达的重组抗体与其抗原有良好的结合活性.     

恶性疟原虫复合多表位基因的原核表达和多克隆抗体制备

原核表达恶性疟原虫多期多表位基因并制备其多克隆抗体。在前期构建恶性疟原虫复合多期多表位重组真核表达载体的基础上,将测序正确的AMAMEG基因克隆入原核表达载体pGEX4T—1并诱导表达。采用包涵体洗涤的方式纯化目的蛋白,以AMA—1抗体对纯化蛋白进行Western—blot分析。将纯化的融合蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。通过PCR成功获得长度为1 000 bp的恶性疟原虫AMA—1胞外域基因片段,获得了与多表位基因连接后的AMAMEG基因。通过诱导表达,显示在相对分子量约95 000处有预计大小的特异性条带,表明成功表达出融合蛋白。经此纯化的融合蛋白免疫的小鼠能产生特异性抗体,其滴度达到1∶105。纯化的融合蛋白和多克隆抗体为研究新型疟疾疫苗奠定一定的理论和实践基础。     

HIV-1复合多表位基因的原核表达和多克隆抗体制备

为表达HIV-1复合多表位基因并制备其多克隆抗体.设计引物,以HIV-1标准株全长cDNA序列为模板,PCR扩增获得p24基因片段;合成改造后的多个表位基因MEG并且与p24片段相连接,克隆入大肠杆菌.将测序正确的p24MEG基因克隆入原核表达载体pET32a并诱导表达.采用Ni2 -NTA亲和柱纯化目的蛋白,以p24抗体对纯化蛋白进行Western-blot分析.将纯化的融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体.通过PCR成功获得长度为651 bp的HIV-1的p24片段,获得了与多表位基因连接后的p24MEG基因,通过诱导表达,显示在相对分子量约45 000处有预计大小的特异性条带,表明成功表达出融合蛋白.经此纯化的融合蛋白免疫的家兔能产生特异性抗体,其滴度达到1:3 200.纯化的融合蛋白和多克隆抗体为研究新型HIV疫苗奠定一定的理论和实践基础.     

从噬菌体抗体库中淘选人绒毛膜促性腺激素的单链抗体

由鼠源噬菌体抗体库淘选到展示有人绒毛膜促性腺激素单链抗体的噬菌体克隆。用ELISA方法进行检测,从结合力最强的克隆中分离单链抗体基因,插入经改造的高效表达载体pET-21a(+)中,转化大肠杆菌,诱导表达。从培养基中可检测到可溶性抗人绒毛膜促性腺激素的单链抗体。     

人源抗HBsAg单链抗体与干扰素嵌合基因的构建及表达

采用重叠PCR技术，将人源性抗HBsAg单链抗体基因与干扰素γ基因用柔性肽段碱基连接成单一基因。序列测定结果表明，克隆的基因与理论上的一致，并将此基因成功构建到酵母表达载体pPICZa上，进而转化到巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)X33中。筛选出的菌落经甲醇诱导培养，对上清液进行SDS—PAGE和WESTERN BLOT分析，在42000处可见蛋白表达带，这为进一步纯化目的蛋白和提高目的蛋白表达水平奠定了基础。     

具有GPX活性单链抗体的制备及其抗氧化效应

为实现单链抗体的可溶性表达, 制备具有谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活力的单链抗体, 在单链抗体表达载体pTMF-2F3上去除原2F3基因N端非必需的18个氨基酸, 采用新的表达载体pRose质粒, 在2F3的N端引入13个氨基酸的前导肽, 转入BL21（lys S）中, 使其分泌到大肠杆菌的周质腔中得以表达, 获得可溶性表达产物. 产物经过分离纯化、 Wester n Blot印迹和硒化测活确定具有GPX活性的鼠单链抗体, 其GPX活力为2 530 U/μmol. 以脂质过氧化、 细胞存活率和细胞膜完整性为指标的抗氧化实验研究表明, 具有GPX活性的单链抗体对大鼠乳鼠表皮细胞有抗紫外线损伤的作用, 是膜脂质过氧化的有效抑制剂.     

藻红蓝α亚基脱辅基蛋白基因的克隆和表达

用ＰＣＲ技术从层理鞭枝藻总ＤＮＡ中扩增藻红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白的基因,将ｐｅｃＡ克隆于ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ;ｔ,然后将ｐｅｃＡ基因插入表达载体ｐＧＥＭＤ,形成的重组质粒在ＢＬ２１（ＤＥ３）中最高效表达,表达蛋白形成包涵体,高效表达的蛋白的分子量为１９×１０＾３,与藻红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白的分子量一致,经Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ进一步证实该表达蛋白为藻红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白。     

抗HBsAg单链Fab抗体基因酵母表达载体的构建

采用重叠PCR技术 ,以抗乙肝表面抗原 (HBsAg)IgG铰链区基因为Linker将Fab抗体基因的重链和轻链连接起来 ,构成单链Fab基因。通过测序鉴定 ,克隆的单链Fab基因与理论上的完全一致 ,并成功构建含完整单链Fab基因的毕赤酵母 (P pastoris)表达载体。     

人源化AGR2单抗在不同宿主细胞中表达的比较

Anterior gradient-2(AGR2)基因是一种与肿瘤生长、转移、浸润及耐药性密切相关的基因,以AGR2为靶点的人源化单克隆抗体rhAGR2-mAb有望成为一种新型的抗肿瘤药物.本研究为了进行该抗体的成药性评价,通过瞬时转染的方法分别用HEK293F细胞与CHO细胞这两种最常用的表达系统表达rhAGR2-mAb,获得了纯度为95%的抗体蛋白,同时比较了不同宿主细胞生产的蛋白在分子量、等电点、糖型等方面的差异,发现在分子量、等电点和糖基化的糖型种类方面,两种宿主细胞表达的rhAGR2-mAb并无明显差异,但两者表达的产物在糖型比例上有较大不同,这也导致了两种表达系统所表达的蛋白与抗原AGR2的亲和力略有不同,为rhAGR2-mAb将来选择合适的蛋白瞬时表达系统和稳定生产系统提供依据.     

德国小蠊Bla g 2的原核表达及其多克隆抗体的制备

利用RT-PCR技术扩增德国小蠊Blag2基因,将其克隆进pET-41b载体.在大肠杆菌中经IPTG诱导表达获得GST-Blag2蛋白,SDS-PAGE分析表达产物,得到相对分子量约74kDa的融合蛋白.通过亲和层析法纯化表达的GST-Blag2蛋白,并以此表达产物制成油乳剂疫苗免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体.间接ELISA法测得抗体效价达到1∶300000.Western印迹表明抗体有较高的特异性,可分别与GST-Blag2融合蛋白和德国小蠊变应原浸提液反应.Blag2在大肠杆菌中的成功表达及其多克隆抗体的制备,为德国小蠊过敏患者的诊断和治疗提供了帮助.     

拟南芥DELLA蛋白编码基因RGA和GAI的原核表达和多克隆抗体制备

通过聚合酶链反应方法扩增了RGA和GAI两个拟南芥DELLA蛋白基因,并将其克隆到pGEX-4T-3原核表达载体上,转化大肠杆菌Rosetta菌株,利用异丙基硫代半乳糖苷诱导表达了分子量为90 kD的GST-RGA和分子量为85 kD的GST-GAI融合蛋白,这两种融合蛋白均以包涵体的形式存在.将包涵体直接作为抗原免疫新西兰白兔,制备出多克隆抗体血清,血清效价超过1:400 000.WB分析结果表明这两种抗体可以特异性识别拟南芥RGA和GAI蛋白,为进一步研究DELLA蛋白的调控机制奠定了基础.     

重组盐藻14-3-3蛋白基因的原核表达及分离纯化

根据克隆的杜氏盐藻14-3-3蛋白的基因序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增杜氏盐藻14-3-3蛋白的基因.经原核表达、Ni2+亲和层析法纯化,免疫动物制备抗体. 抗体蛋白质印迹分析检测结果表明抗体能特异结合盐藻细胞分子量为29 kD的多肽.     

拟南芥AtERF1蛋白的原核可溶性表达及多克隆抗体的制备

转录因子AtERF1属于ERF/AP2家族的B3亚家族,参与植物的防卫反应.根据密码子简并原理,用基因全合成的方法合成了满足大肠杆菌密码子嗜好的编码拟南芥AtERF1蛋白的碱基序列,并将其克隆到原核表达载体pET-29b.将表达载体AtERF1-pET-29b转入大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG成功诱导表达了分子量约30kD的AtERF1蛋白,该蛋白主要以可溶性蛋白的形式存在.以该蛋白为抗原免疫家兔,制备出的多克隆抗体经免疫双扩散测定效价达1∶16,Western blot检测表明该抗血清与AtERF1蛋白识别良好.AtERF1抗体的制备为进一步从生化水平上研究AtERF1的功能奠定了良好基础.     

基于抗体的小麦赤霉病抗性研究进展

 由镰刀菌引起的小麦赤霉病,不仅降低产量和品质,所形成的真菌毒素还会影响食品安全。植物缺乏高抗小麦赤霉病的资源,因此从动物中筛选、分离抗病抗体及其基因,可为培育植物抗病品种提供新种质,也拓展了开发研究新抗源的渠道。抗病抗体能特异靶向真菌蛋白、抑制抗原的功能;抗体与抗菌肽和顺式表达调控元件结合,使病菌能诱导抗体融合蛋白在镰刀菌侵染小麦的颖壳高效表达,从而有效抑制病菌侵入、扩展及毒素积累。本文综述抗病抗体的抗原类型、抗病抗体及其融合蛋白在体外和植物中的表达以功能、抗原基因结构与功能、抗体抗病机理的研究进展。     

一种导向性溶栓剂的基因构建及其在大肠杆菌中的表达

以针对人活化血小板表面糖蛋白GMP140的单克隆抗体SZ51的单链抗体作为导向分子,以单链尿激酶32kd变体(scu-PA-32k)作为效应分子,构建了一种新型的导向性溶栓剂。通过聚合酶链式反应(PCR),分别从SZ51的Fab片段基因中扩增出V_K和V_H区;从尿激酶原基因中扩增出scu-PA-32k基因。通过合适的linker及酶切位点,将V_K, V_H及scu-PA-32k基因相连接并装入表达载体pET-5a中的Nde I位点,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达了重组蛋白。Western-Blotting检测到在8mol/L尿素存在下,该重组蛋白与抗尿激酶的多克隆抗体之间仍有弱的结合反应。表达产物经变复性处理和部分分离纯化后,在纤维蛋白平板上表现有较好的纤溶活性,且这种活性是通过激活纤维蛋白溶酶原为纤溶酶而实现的。重组蛋白纤溶活性的比活达到17500IU/mg,较好地保留了尿激酶的纤溶活性,重组蛋白的产率约每100g湿菌为1.5mg。     

拟南芥蛋白激酶CDPK11融合蛋白的纯化及鉴定

CDPK11是钙依赖蛋白激酶家族的重要成员,为了获得纯化的His-CDPK11融合蛋白,首先克隆了1 488bp的CDPK11全长基因,酶切连接构建到pGEX-4T-3载体上,获得His-CDPK11原核表达载体并转化大肠杆菌表达菌株BL21;经IPTG诱导和His镍柱体系纯化获得分子量为50ku的His-CDPK11融合蛋白;Western blot免疫印迹技术检测证实该蛋白能被Anti-His抗体识别,表明获得了正确融合的His-CDPK11蛋白,为进一步解析CDPK11参与植物开花调控的分子机制提供了有力的工具.     

麻疯树亚硝基谷胱甘肽还原酶（JcGSNOR）的克隆与功能分析

本研究克隆出了麻疯树亚硝基谷胱甘肽还原酶（JcGSNOR）cDNA的全长序列,并分析了其在麻疯树各部位中的表达情况.结果表明,在所有参试的器官中,JcGSNOR基因皆有表达,其中在种子种表达量最大,其次为根茎,叶表达量最少.对新基因编码蛋白的理化性质进行分析后发现JcGSNOR的分子量约为40.256 kDa,等电点约为6.74;同源性分析表明,JcGSNOR基因与其它植物GSNOR基因核甘酸序列相似度达到80%以上,说明JcGSNOR是GSNOR蛋白家族的一个新发现的成员.同时将JcGSNOR基因与pY     

截短型HCV NS5B RNA聚合酶在大肠杆菌中表达纯化及鉴定

为构建HCV截短型ns5bΔ21基因的原核表达质粒;在大肠杆菌中表达NS5B蛋白并纯化,制备其抗体。运用软件设计引物,以BB7复制子为模板PCR扩增ns5bΔ21基因;克隆入原核表达载体pRSETA。将重组表达质粒pRSETA-ns5bΔ21转化BL21大肠杆菌,并诱导表达、可溶性分析及纯化;用纯化的NS5B蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。结果酶切鉴定和序列测定表明成功的构建了重组表达质粒pRSETA-ns5bΔ21;其经IPTG诱导后行SDS-PAGE可见新生表达条带,Western-blot证实了其特异性和抗原性良好;利用镍离子亲和层析和电洗脱方法获得了纯化NS5B蛋白;用纯化蛋白免疫小鼠制备出了多价抗血清。说明表达和纯化的截短型HCV NS5B RNA聚合酶可用于下一步筛选单链抗体。     

抗PAF单链抗体的基因构建及蛋白质3D模建

构建抗PAF单链抗体的基因并通过计算机模建分析几种不同连接类型的单链抗体空间结构差异。采用重叠延伸PCR方法扩增了VH和VL基因,形成抗PAF的VH-Linker-VL(ScFv)基因产物,并经菌落PCR和测序分析鉴定,通过Internet对其3D结构进行了模建与分析,研究结果表明：PCR产物电泳可见一条与目的基因大小一致的片段,经菌落PCR和测序分析鉴定,抗PAF单链抗体的基因构建成功;VH和VL在单链抗体中的顺序对单链抗体3D的空间结构有影响。