蛋白质二硫键异构酶既是酶又是分子伴侣

蛋白质和新生钛折叠的概念近十年来发生了重大的转变。新生肽成熟为功能蛋白需要分子伴侣和折叠酶的寿命才能完成。蛋白质二硫键异构酶是一种折叠酶,同时也有分子伴侣活性,该假说得到越来越多体内外实验的支持。分子伴侣活力可能是酶分子在进化过程中获得的新的性质,以提高酶催化效率,并在与蛋白质折叠有关的生命活动中发挥新的功能。     

蛋白质二硫键异构酶的二硫键不是其活力所必需

蛋白质二硫键异构酶(Protein disulfide isomerase,PDI,EC 5.3.4.1)催化蛋白质分子中疏基与二硫键的交换反应,并被普遍认为催化细胞内蛋白质生物合成过程中天然二硫键的形成.虽然根据PDI的cDNA序列所推断的氨基酸序列中,每个亚基只含6个Cys残基,完全还原的PDI在不同的实验室所测得的疏基数目却都为7,Carmichael等报道,不经还原剂还原的PDI含有三个自由疏基和两对二硫键,但Gilbert等报道PDI含有三对二硫键.PDI亚基中含有两段高度重复序列1—100和350-450,这两段序列和大肠杆菌的硫氧还蛋     

链霉菌M1033同源重组葡萄糖异构酶缺陷型菌株的构建

为实现有工业生产价值的葡萄糖异构酶双突变体酶ＧＩ（Ｇ１３８Ｐ－Ｇ２４７Ｄ）的稳定高效表达,在建立７号淀粉酶链霉菌Ｍ１０３３原生质体转化条件的基础上,构建了含６００ｂｐ不完整ＧＩ（Ｇ１３８Ｐ－Ｇ２４７Ｄ）结构基因片段的插入型同源重组质粒ｐＸＷ,并通过同源重组模式整合到Ｍ１０３３的染色体上,实现了ＧＩ基因的破坏（ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）,获得了同源重组葡萄糖异构酶缺陷型菌株。对同源重组片段的分     

不同聚合态胰岛素的晶体学研究:重组突变体B9(Ser→Asp)人胰岛素的系列结晶及其初步晶体学研究

用基因工程方法制备的B9(Ser→Asp)人胰岛素突变体是一种速效胰岛素.报道这一突变体的晶体生长,初步晶体学分析及衍射数据收集与处理.在不同的晶体生长条件下,分别得到了正交、四方、三方3种晶型的晶体.突变分子在不同晶型的晶体中以不同聚合方式存在,其构建单位分别是二体和六体.通过对这3种不同晶型的晶体结构解析和比较研究,将对此突变体的速效特性的结构基础以及胰岛素在不同条件下的自聚合特征有更深入的了解.     

不同聚合态胰岛素的晶体学研究:重组突变体B9(Ser→Asp)人胰岛素的系列结晶及其初步晶体学研究

用基因工程方法制备的Ｂ９（Ｓｅｒ→Ａｓｐ）人胰岛素突体是一种速效胰岛素。报道这一突变体的晶体生长,初步晶体学分析及衍射数据收集与处理。在不同的晶体生长条件下,分别得到了正交、四方、三方３种晶型的晶体。突变分子在不同晶型的晶体中以不同聚合方式存在,其构建单位分别是二体和六体。通过对这３种不同晶型的晶体结构解析和比较研究,将对此突变体的速效特性的结构基础以及胰岛素在不同条件下的自聚合特征有更深入的了解     

精原干细胞移植治疗不孕不育小鼠模型的初探

通过曲细精管显微注射法, 将从雄性FVB/NJ-GFP转基因小鼠睾丸内分离得到的精原干细胞注射进不孕不育动物模型—— BALB/c雄性裸鼠的睾丸曲细精管中, 对其生精现象进行了深入的分析. 为了进一步验证精原干细胞移植后的雄鼠重新获得生殖能力, 这些雄鼠被用于自然交配, 并以编码GFP荧光蛋白的cDNA为杂交探针, 用Southern Blot方法分析其后代小鼠的基因型. 实验结果表明, 作为移植受体的不孕不育BALB/c裸鼠是一种免疫缺陷性小鼠, 能较好地避免供体和受体之间的免疫排斥反应. 供体精原干细胞可以在68.33% (41/60)进行移植实验的受体小鼠睾丸内存活、迁移和增殖, 并在受体睾丸内腔中发育成成熟的精子, 有5只杂交后代小鼠的基因型呈现为GFP阳性. 本实验室建立了曲细精管显微注射技术, 并在利用精原干细胞移植治疗不孕不育小鼠的实验中获得了初步成功. 精原干细胞移植技术在探讨精子发生机理、重建不育个体的精子发生和恢复不育症患者的生育能力等方面有着重要的应用前景.     

用精原干细胞移植技术制作转基因动物的研究前景

在生物科学、生物医学、畜牧业科学和生物反应器的研究中, 转基因动物是非常有用的工具. 然而, 最常用的制作转基因动物的方法, 如原核显微注射和核移植效率都非常低. 在最近10年中, 研究人员利用精原干细胞移植技术发明了一系列新方法. 其中的一些方法一旦与遗传修饰方法相结合, 就会形成一套制备转基因动物的新方法. 本文综述了与转基因动物制作相关的精原干细胞移植研究成果, 如精原干细胞移植技术、精原干细胞的冷冻保存方法、精原干细胞移植受体的准备、精原干细胞的长期增殖和传代培养、精原干细胞的遗传修饰及外源基因的遗传特性等, 描述了用精原干细胞移植技术制作转基因动物的一整套方法. 根据所用供体和受体的不同, 将这种新的转基因动物制作方法分为两类: 同种移植法和同体移植法. 这一研究领域的进展虽然迅速, 但是每一种方法仍然有潜在的困难有待于克服. 本文对这些新方法的优点和目前存在的问题进行了探讨.2     

用酵母双杂交系统筛选与NifA相互作用的蛋白质

利用酵母双杂合系统从巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)Sp中筛选与NifA有直接相互作用的蛋白质因子. 首先将nifA基因克隆到pGBD-C2载体上, 构建成诱饵质粒pGBD-nifA, 接着将巴西固氮螺菌的染色体DNA构建在pGAD-C1, pGAD-C2和pGAD-C3质粒载体上, 形成3个质粒文库YSPC1, YSPC2和YSPC3. 然后以pGBD-nifA为诱饵, 对YSPC1, YSPC2和YSPC3这3个文库进行了筛选, 得到11个阳性克隆. DNA序列分析表明, 这11个阳性克隆分为4类, 包含4个1~1.3 kb不同的基因片段. 对这4个基因片段进行同源性比较发现, 其中2个编码的蛋白质含有与信号传递有关的PAS结构域, 另外1个基因片段含有与吸收铁有关的fhuE基因, 另一个是未知蛋白. 将这4个基因片段从原来的pGAD载体转移到pGBD载体, 即互换换载体后, 它们仍然与NifA有相互作用; 对这4个基因片段进行移码突变则不再与NifA有相互作用, 说明了它们与NifA相互作用的特异性.     

用Caco-2细胞单层模型比较两种具类胰岛素效应的氧钒配合物的小肠吸收能力

应用Caco-2细胞单层肠吸收模型比较了两种结构相似但降糖效应显著不同的重要氧钒配合物双乙酰丙酮氧钒（VO（acac）2）和双麦芽酚氧钒（VO（ma）2）经肠道的吸收能力.实验发现,两种钒化合物都通过被动扩散的途径转运,其表观渗透系数（顶端→底端）分别为（82.0±6.7）×10-7和（14.6± 0.7）×10-7cm·s-1;表明VO（acac）2的吸收能力远远大于VO（ma）2.这可能与化合物及其配体在转运过程中的代谢有关.吸收的差异可能导致两种化合物生物利用度的巨大差别,这可能是VO（acac）2降糖效应优于VO（ma）2的主要原因.