乌塌菜叶绿素降解代谢调控相关基因BcNYE1的克隆和分析

采用电子克隆策略结合RT-PCR从乌塌菜中分离得到了AtNYE1的同源基因BcNYE1完整编码区序列,并对其进行基因组组成和功能研究.BcNYE1的开放阅读框(ORF)长870 bp,编码289个氨基酸残基;基因组序列全长为1 132 bp,有2个内含子和3个外显子.为了验证BcNYE1基因的功能,构建了植物双元表达载体pCHF4-BcNYE1,采用冻融法导入农杆菌GV1301,通过花蕾浸染法转化拟南芥滞绿突变体nye1-1.对所获得的卡那霉素抗性植株进行PCR、RT-PCR检测,结果表明,在得到的转基因株系中,BcNYE1基因已整合到受体植物基因组中,并且可以转录成mRNA.互补实验结果显示,BcNYE1基因不具备互补拟南芥滞绿突变体nye1-1叶绿素降解缺陷的功能.     

植物转录因子及其基因研究策略

在植物细胞中,一个转录因子对共同控制某个性状的多个基因的表达进行调控。在转录因子基因的克隆及其功能的确定的研究方面,出现了相对传统的正向基因组策略而言的反向基因组策略和很多的技术手段,如T－DNA或转座子插入突变法,RNA干扰法,基因组成型表达法（加强功能法）,DNA芯片等。对转录因子的研究成果也开始应用在改良植物的抗寒,抗盐等抗性方面,现在拟南芥的基因组的序列测定已经完成,所有的转录因子的基因都会作功能上的分析,这将是植物遗传学上的一个里程碑。对于转录因子的研究中,拟南芥是主要的研究对象,本也主要以拟南芥为主要的说明对象。     

拟南芥中MRG2与BAF60相互作用的研究

拟南芥MRG2(Morf Related Genes 2)是MRG蛋白家族成员之一,可以识别组蛋白H3K4和H3K36甲基化修饰,但是对于它是否具有其他生物学功能,目前了解还非常有限.我们首先通过免疫共沉淀结合质谱分析获得了MRG2结合蛋白,并对其中一个染色质重塑SWI/SNF复合体亚基BAF60蛋白进行了深入研究.体外Pull-down和双荧光互补实验证实了MRG2和BAF60在植物体内体外都能相互作用.已有研究表明:BAF60抑制异戊烯转移酶IPT(ISOPENTENYL TRANSFERASE)基因转录.RNA-seq和RT-qPCR数据都表明在mrg1mrg2双突变拟南芥植株中多个IPT基因转录水平明显升高.ChIP实验结果证明MRG2蛋白富集于IPT3基因编码区.综上所述,在植物细胞中MRG2和BAF60蛋白相互作用共同调控了IPT3基因的转录.这些研究对于理解MRG2在基因表达调控方面的功能具有重要意义.     

桃树抗寒相关的叶绿体新基因PpRBD1的克隆及特征分析

为确定桃树细胞质抗寒相关基因,依据模式植物拟南芥中抗寒相关的RBD1基因,结合桃基因组数据设计并克隆到一个桃PpRBD1基因。该基因全长2 230 bp,编码513个氨基酸;结构域分析显示,该氨基酸序列含有RRM(RNA recognition motif)保守结构域,是与拟南芥RBD1同源的蛋白;亚细胞定位预测表明,该基因编码的蛋白可能在叶绿体中表达。该基因可能在桃抵抗寒冷胁迫中发挥重要作用。     

转录物组学解析植物生长发育的生物钟调控模

基于拟南芥的时间序列的基因组芯片数据,分析了植物生长的昼夜调节模式相关的基因表达规律,发现有2.4%的基因的日振幅达到了显著差异水平.从整体基因转录组水平分析,白天诱导表达的基因主要参与调控植物与环境之间的相互作用,而夜晚表达上调的基因主要参与调节植物的生长发育.此外,植物叶绿素和血红素的生物合成也受到了生物钟的调控.对整个基因组水平上生物钟核心震荡调节子CCA1/LHY和TOC1的共表达基因做了基因组水平上的扫描鉴定,得到了一些新的潜在的生物节律调节因子.这些结果为今后更为系统地完善植物的生物节律的调控网络提供了参考.     

甘蓝抗病基因同源序列分离的初步研究

根据已分离植物抗病基因N(烟草)、RPS2(拟南芥)和L6(亚麻)的保守区域设计简并引物,从抗TuMV甘蓝材料84075第1链cDNA中扩增出1个与植物抗病基因同源的序列,经克隆测序结果表明,该基因片段与许多NBS类抗病基因同源,Southem杂交分析表明甘蓝抗病基因同源序列在基因组中以多基因家族的形式存在.     

小拟南芥ApCBF基因的克隆及转化烟草的初步研究

CBF是植物冷驯化过程中的关键性调节因子。利用PCR及染色体步移法从新疆特有拟南芥近源种植物——小拟南芥的基因组中克隆了CBF基因的同源序列（DQ207404）。生物信息分析表明，该序列具有完整的读码框，推定的蛋白质序列与拟南芥CBF1，2，3的相似性分别为：87．6％、86．6％和88．1％。以植物表达载体pBI121为基础，构建了由组成型启动子35S调控ApCBF的植物表达载体pCB111。通过根癌农杆菌介导，采用叶盘法转化烟草，PCR检测初步证明却ApCBF基因已整合到烟草基因组中。为利用ApCBF基因改良植物抗逆性奠定了物质基础。     

北京农业生物技术研究中心

经过10年的发展,该中心形成了多个在国内处于优势的领域:(1)植物转基因育种:已经有7种转基因植物完成中试,2种进入环境释放。(2)植物功能基因组研究:定位了拟南芥和大白菜抗软腐病基因,构建了第一张十字花科蔬菜——白菜DNA芯片;构建了多枝赖草的TAC DNA文库;获得了完整新基因100多个。(3)植     

小拟南芥COR15a基因的克隆及序列分析

拟南芥的CORl5a基因受低温处理、ABA及干旱诱导表达,与植物的低温驯化有关。根据拟南芥序列。利用PCR技术从小拟南芥基因组中克隆了AtCORl5a的同源基因ApCOR15a。2个基因具有相同的结构,ApCORl5a编码139个氨基酸,其序列有84％与AtCORl5a蛋白相同。     

拟南芥生态型Zu-0减少主茎分枝的遗传机理探究

植物分枝发育很大程度上决定了植物地上部的形态结构,在植物的形态建成中占有非常重要的地位.它又与作物的生物量和结实量有着密切的关系,是作物的重要农艺性状之一.以实验室常用拟南芥生态型Col-0和减少主茎分枝(RSB)的生态型Zu-0为亲本,构建了包含192个株系的重组自交系群体.利用分离群体分组分析法(BSA)检测出与RSB性状连锁的13个分子标记.最终初定位到4个减少主茎分枝的数量性状位点(QTL).qRSBZu-2和qRSBZu-3区域分别含有已知的同时控制开花时间和减少主茎分枝表型的FRI和FLC基因.qRSBZu-1和qRSBZu-4区域尽管含有已知分枝调控基因AGL6和CUC2,但AGL6和CUC2测序结果表明这2个基因在Col-0和Zu-0中没有编码氨基酸的改变,而且AGL6的表达量也没有改变,表明这2个位点还存在着其他基因参与了RSB性状的调控.构建杂合自交家系(HIF)群体,对qRSBZu-1和qRSBZu-4的真实性进行了验证.     

拟南芥、水稻和杨树ACTIN家族全基因组分析

鉴定了覆盖拟南芥、水稻和杨树3种模式植物全基因组的20个拟南芥、18个水稻、22个杨树ACTIN蛋白基因,对其染色体定位、基因结构、基因复制等进行了综合分析.并在系统进化分析基础上,将ACTIN基因家族分为12个亚家族,有助于揭示植物ACTIN基因家族的进化历史,为后续ACTIN基因家族的功能提供线索,对研究植物ACTIN基因家族功能和进化上的多样性提供理论基础.     

辣椒热激转录因子家族在驯化过程中的演变

以拟南芥HSFs基因家族的已知信息为基础,挖掘辣椒栽培品种及其野生祖先品系基因组中HSFs基因,并对这些基因进行系统的比对和功能分析。在栽培辣椒遵辣一号基因组中共鉴定出25个HSFs基因,其野生祖先品系Chiltepin中鉴定出26个HSFs基因。从HSFs基因的染色体位置看,与其野生祖先品系Chiltepin比较,遵辣一号HSFs基因家族基本是一致的,在驯化过程中没有发生大的变化。与拟南芥一样,辣椒HSFs基因家族分成了A/B/C3个亚家族。从系统发育树中,可以清晰的看到辣椒HSFs基因在拟南芥中的同源基因。与拟南芥抗逆重要基因HSFA2基因同源的是遵辣一号的Capana08g000497与Chiltepin野生辣椒品系的Capang01g003145基因。这一重要的抗逆基因在驯化过程中,由Chiltepin一号染色体移动到遵辣一号的八号染色体。本研究为分析辣椒HSFs基因家族成员的功能提供了有价值的信息,为辣椒品种多种抗逆能力的改善,积累基因资源。     

甘蓝型油菜SHR蛋白基因鉴定与结构分析

植物SHR蛋白属于GRAS蛋白转录因子家族,保守羧基端含有VHIID结构域,氨基端不保守,参与调控植物物质合成和生长发育.参照拟南芥At SHR基因的CDS序列,采用生物信息学的方法在甘蓝型油菜数据库中鉴定出3个Bn SHR基因,进而分析其基因结构、生化特性、进化关系和蛋白结构.研究结果显示3个Bn SHR基因中有2个位于C基因组(来源于甘蓝)上,1个位于A基因组(来源于白菜);3个Bn SHR基因的氨基酸序列一致性为88.25%,与At SHR基因在进化上也高度同源,SHR基因在结构和功能上保守;亚细胞定位预测显示Bn SHR蛋白可能定位于过氧化物酶体,参与种子萌发过程中脂肪转变为糖分的过程;PHYRE2预测了Bn SHR蛋白的三级结构,由于序列的差异性导致了氨基末端处结构相差较大,但VHIID保守区结构类似,为β-折叠.     

利用寡核苷酸芯片进行拟南芥SO2胁迫基因表达谱分析

运用拟南芥寡核苷酸芯片ATH1,分析SO2胁迫对拟南芥基因表达谱的影响.在22 810个探针中共检出30 mg*m-3SO2胁迫组与对照组间表达改变1倍以上的基因494个,其中上调220个,下调表达274个,主要涉及与细胞代谢(189个)、结合(177个)、转录调控(74个)、结构分子(55个)、信号转导(53个)、物质运输(39个)等功能相关的基因.胁迫组中与细胞防御相关的基因,包括防御酶基因、病程相关蛋白PRs和细胞壁防御相关基因等表达上调.结果表明,SO2胁迫时植物细胞能够通过对基因转录的调控,从分子水平上改变细胞的生理过程,提高植株对逆境的适应性.     

普通野生稻中NBS同源序列的克隆和分析

已知的植物抗病基因大多数具有核苷结合位点（NBS）和富含亮氨酸重复（LRR）。根据NBS的保守区设计引物,应用聚合酶链式反应（PCR）,从普通野生稻基因组中克隆了4个不同的NBS同源序列（OSNBA1－OSNBA4）。同源性比较显示它们均与非TIR类的NBS序列相似,其中,OSNBA1与双子叶植物拟南芥的RPS2基因更接近;OSNBA2－OSNBA4与单子叶植物水稻的XA1、RPR1基因更相似。     

植物MYC1基因拟南芥表达载体构建及鉴定分析

随地球环境污染,气候变化问题愈发严重,植物生长过程中面临的极端环境风险也随之增加,植物所受环境胁迫中缺铁胁迫广泛存在。文章以拟南芥基因组DNA为模板,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增克隆拟南芥MYC1基因启动子区域,经过酶切和连接,与GUS(β-葡萄糖苷酸酶)表达载体构建融合表达载体ProMYC1-GUS。通过浸花法侵染野生型拟南芥植株获得转基因材料,并对ProMYC1-GUS转基因材料进行缺铁诱导GUS组织染色,证明植物MYC1基因在缺铁胁迫下表达受到抑制。     

拟南芥CBF基因的克隆

CBFs是拟南芥中能与低温响应元件CCGAC结合的转录因子，通过诱导冷调节基因(COR)的表达从而增强植物的耐冻性。CBFs由一个小的基因家族编码，包括3个成员：CBF1、CBF2和CBF3，在序列上高度相似。我们根据其编码基因的启动子和终止子中的一致序列，设计了一对PCR引物，用一次反应即同时获得了这3个基因的克隆。     

小立碗藓CAS基因的克隆及与拟南芥CAS基因的比较

钙信号在动植物的生长、发育过程中具有不可替代的作用.胞外钙受体(Extracellular Calcium-sensing receptor,CAS)是动植物质膜上一种跨膜离子通道蛋白,可以感受胞外Ca2 水平,充当第一信使将胞外的信号传递到细胞内.但迄今为止,仅2003年从植物拟南芥中克隆了胞外钙受体CAS基因,其起源进化我们知之甚少.本实验成功克隆了小立碗藓CAS基因,其cDNA全序列共1 574 bp,5′-非翻译区80个核苷酸,3′-非翻译区234个核苷酸,开放阅读框(ORF)1 257 bp,编码419个氨基酸,共有6个内含子.虽然藓类植物与被子植物进化距离较远,但小立碗藓CAS基因前五个内含子的插入位置以及相位与拟南芥完全相同,这说明植物中CAS基因在漫长的进化过程中非常保守,暗示被子植物胞外钙离子信号感受、传递机制起源于藓类植物.     

沙冬青AmDREB1F基因的克隆与表达载体构建

DREB(dehydration responsive element binding protein)类转录因子在植物耐逆性中起重要作用.利用RNA-Seq技术从蒙古沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)中鉴定出一个受低温和干旱强烈诱导的DREB基因,并用PCR方法克隆到其完整编码区的cDNA和gDNA.二者均由726bp组成,故无内含子.推测其蛋白产物含241个氨基酸残基和1个保守的AP2结构域及核定位信号,很可能定位于细胞核.因为与拟南芥等植物DREB1F蛋白同源性较高,故将该基因命名为AmDREB1F.将其编码区cDNA片段成功构建到植物表达载体pCAMBIA3301上,为进一步研究其功能奠定了基础.     

SPL家族基因复制及功能分化分析

【目的】基因复制及随后的功能分化是基因组和物种演化的重要驱动力。植物特有的转录因子家族SPL(SQUAMOSA-promoter binding protein like)广泛参与调控植物生长发育及响应逆境胁迫,为研究重复基因的起源方式和进化命运提供了良好的研究系统。本研究对葡萄(Vitis vinifera)、番木瓜(Carica papaya)、毛果杨(Populus trichocarpa)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)4种模式植物的SPL基因家族开展基因复制及功能分化分析,为进一步研究SPL基因功能、预测种属特异性的功能基因提供系统进化角度的参考。【方法】利用SBP特征结构域,鉴定葡萄、番木瓜、毛果杨和拟南芥4种模式植物中SPL基因家族成员,并利用最大似然法构建系统进化树。基于物种内、物种间基因组共线性,分析SPL基因家族发生基因复制的方式及差异保留情况,并计算保留的SPL直系和旁系同源基因的同义、非同义替换率,分析功能分化情况。【结果】在4种模式植物中共鉴定出SPL基因73个,其中42个是miR156的靶基因。系统进化分析显示:73个SPL基因聚类为9个主要分支,miR156靶向SPL基因成簇聚集在6个主要分支;Clade I中SPL基因编码的2个锌指结构基序为C4和C₂HC,而其余8个分支中SPL基因的锌指结构基序由C3H和C₂HC组成。大规模基因组复制事件(片段复制或全基因组复制)是SPL基因家族发生基因重复的主要方式。根据基因组复制事件推算,15个古基因位点理论上应复制出的360个位点中,83.6%的重复位点发生丢失或演化成非SPL基因。本研究鉴定出旁系同源基因17对,直系同源基因27对,且所有旁系和直系同源基因的K_a/K_s(非同义替换率和同义替换率之比)值均小于1。【结论】在不同物种中保留下来的SPL直系同源基因受到较强的纯化选择,在功能上具有保守性;同一物种中保留下来的SPL旁系同源基因在进化过程中维持部分功能冗余,但在组织表达偏好性和蛋白功能上已呈现出不同形式的分化。