16S rRNA基因的PCR-DGGE技术分析茶尺蠖幼虫肠道细菌种群结构及多样性

利用16S rRNA的PCR-DGGE（变性梯度凝胶电泳）技术分析研究了茶尺蠖肠道内细菌的种类与多样性.通过对16S rRNA序列分析,从茶尺蠖野外种群肠适中鉴定了11种细菌,这些细菌分属于沃尔巴克氏菌（Wolbachia）、肠杆菌属（Enterobacter）、沙雷氏菌属（Serratia）、梭菌属（Clostridium）、肠球菌属（Enterococcus）、暂定类群EO1;其中以肠杆菌、沃尔巴克氏菌、沙雷氏菌属最为常见.另外,也鉴定了一种茶树叶绿体上的16SrRNA基因.茶尺蠖幼虫体内的共生菌多样性分析结果,将会为害虫综合治理提供一条全新的探索途径.     

PCR-DGGE技术在农村户用沼气发酵微生物研究中的初步应用

通过PCR-DGGE技术,对北京郊区一运行良好的农村户用沼气池的细菌多样性分析,分别在1、3、4、5月份采集沼气池的厌氧活性污泥样品,提取厌氧活性污泥微生物总DNA,对其16S rDNA基因的V3可变区进行扩增,结合DGGE(变性梯度凝胶电泳)技术,跟踪检测微生物的动态变化,并利用软件对DGGE图像进行聚类分析.测定了厌氧活性污泥DGGE胶上优势和差异条带16S rDNAV3区片段序列,通过与NCBI数据库中的序列基因库比对,初步确定细菌的种属.结果表明:农村户用沼气池中发酵微生物种类较为丰富,但有明显的优势种群,随着气温变化,微生物多样性基本稳定,但种群丰度有明显变化,DGGE图谱中的优势条带16S rDNA基因序列经比对后都属于未培养的细菌.     

DGGE法检测稻田蓝细菌及硅藻的遗传多态性

运用对蓝细菌和硅藻16SrRNA特异的引物对，将稻田土壤中提取的总DNA进行PCR扩增后，通过DGGE技术对PCR产物进行分析。结果表明，在水稻生长的不同时期，稻田蓝细菌及硅藻种群也在变化，田间不同位置蓝细菌及硅藻种类也有所不同，并且每 一时期都有其优势的蓝细菌及硅藻种群。     

分子生态学方法对油藏细菌群落结构分析的比较

目前对油藏细菌群落结构分析方法繁多,为得到准确全面的群落分析结果,必须选取合适的方法。群落分析方法的优劣进行比较分析,选取从新疆陆梁油田注水井筛出的11株单菌,测定其16srDNA序列,制成包含7个菌属、9个菌种的混合菌液。应用基于PCR扩增的三种分子生态技术DGGE、T-RFLP、建立16SrDNA文库比较和分析了混合菌液细菌多样性。使用PCR-DGGE方法时发现,DGGE方法可灵敏地检测到序列1 bp的变化,能将不同菌株分开,但该方法经过切胶测序后的的目标序列较短,信息量不大且有时有一定误差,较适合用于定性对比;而用于菌群结构的分析时应结合其他方法。T-RFLP法可区分大部分菌属,但数据库不够完整,不能确定细菌群落组成;因此也不适合单独用在细菌群落检测中,可用作多个样品种群多样性的对比或结合其他方法对样品进行系统透彻解析。建立16srDNA克隆文库法成功鉴定到7个菌属8个菌种16SrDNA序列,更适用于油藏细菌群落结构的分析。     

青海茶卡盐湖嗜盐碱芽胞杆菌资源分析

采用3种不同的培养基,通过可培养法,从青海茶卡盐湖样品中共分离获得110株嗜盐碱芽胞杆菌.基于16S rRNA基因序列相似性鉴定及系统发育分析,得出这些菌株为芽胞杆菌10个属的41个种,它们与最近匹配模式菌株的16S rRNA基因序列相似性在96%~100%之间,以芽胞杆菌属为优势菌,共计25种83株;存在6个潜在新种.3种酶筛实验结果表明,87%的嗜盐碱芽胞杆菌菌株具有产酶能力,产蛋白酶70株,产纤维素酶81株,产木聚糖酶50株.青海茶卡盐湖中的芽胞杆菌种类丰富多样且能产多种酶,并且潜藏着新的微生物物种,研究结果可为嗜盐碱芽胞杆菌资源开发提供理论基础.     

乌江网箱养殖丁(魚歲)细菌的分离与分子鉴定

利用微生物学常用的细菌分离、纯化方法从丁(魚歲)中分离出9株菌株,编号分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ.分别扩增出9株菌株的16S rRNA基因约600 bp的片段,并对其测序,将测序结果输入到NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中,用BLAST工具对序列进行同源性比对分析,并利用MEGA4绘制系统进化树,结果表明:9株菌株的16S rRNA基因测序结果分别与不动杆菌(Acinetobacter)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophi-la)、希瓦氏菌(Shewanella baltica)、不动杆菌(Acinetobacter)、希瓦氏菌(Shewanella baltica)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)的16S rRNA基因的核苷酸序列同源,同源性分别为96%,99%,99%,97%,98%,98%,99%,98%,98%.9株菌株的系统进化树明显分为3支,Ⅰ和Ⅳ聚为一支,Ⅶ独聚一支,Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅷ、Ⅸ聚为一支,其中Ⅱ和Ⅷ相聚,Ⅲ和Ⅴ相聚后再与Ⅵ相聚,最后与Ⅸ相聚.     

基于groEL基因序列鉴定丹毒丝菌属菌种

对4株红斑丹毒丝菌的16SrRNA基因和groEL基因进行测序及系统发育分析,探讨groEL基因序列分析法在丹毒丝菌属菌种分类鉴定中的应用.测序结果表明,4株红斑丹毒丝菌groEL基因长度为1 614bp,编码由537个氨基酸残基组成热休克蛋白HPS60,与红斑丹毒丝菌ATCC19414株和扁桃体丹毒丝菌ATCC43339株groEL基因的同源性分别为99%和86%,而16SrRNA基因长度为1 351bp,与红斑丹毒丝菌ATCC19414株和扁桃体丹毒丝菌ATCC43339株的同源性均为99%.系统发育分析结果表明,groEL基因比经典的16SrRNA基因序列分析分辨率高,可适用于红斑丹毒丝菌和扁桃体丹毒丝菌的分类鉴定.     

PCR-DGGE用于浓香型大曲微生物群落分析的条件优化

试验对浓香型大曲微生物群落的PCR-DGGE电泳最佳变性剂梯度范围、电泳时间进行了优化。结果表明:细菌DGGE电泳最佳变性剂浓度梯度为35%～55%;而真菌DGGE电泳最佳变性剂浓度梯度为30%～50%。通过时间进程法得出最佳电泳时间为16小时。运用此优化后的PCR-DGGE技术对不同时期曲药微生物群落进行了研究,获得了较丰富的微生物多样性。     

不同16SrDNA靶序列PCR-DGGE分析油页岩细菌多样性

为全面了解油页岩细菌群落组成结构,同时筛选出适于油页岩PCR-DGGE的最佳引物,采用改进SDS高盐提取法,提取抚顺西露天矿油页岩微生物总DNA,并用968F/1401R,338F/518R,341F/907R和1055F/1406R,对16SrDNAV6-V8,V3,V8和V9区进行PCR-DGGE分析.结果表明,4组引物均能较好扩增出目的基因,但不同靶序列对多样性检出有显著影响(P<0001);与其他引物相比,968F/1401R和338F/518R获得的指纹图谱物种丰富度更高,检出细菌类群更丰富,较适合油页岩样品.油页岩细菌群落组成较简单,优势细菌包括不动杆菌属、假单胞菌属和埃希氏菌属,同时还有假单胞菌目和肠杆菌目尚未被鉴定的一些种类.     

利用PCR-DGGE技术分析微生态制剂在传代过程中的菌群变化

利用变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE）技术,结合传统平板培养法对实验室研制的1种由乳酸菌和芽孢杆菌组成的微生态菌剂WS-401及其在连续转接培养过程中细菌种群组成的动态变化进行分析。WS-401原液的活菌数为2×107 cfu/mL,且细胞个体形态多样。将分离自原液的3株细菌进行DGGE分析,出现2种指纹谱带,对照标准的DGGE指纹图谱库和序列分析,分别被鉴定为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）。将该菌剂分别在LB和MRS两种培养基中30℃或37℃连续转接5次,DGGE分析每次转接后培养物的菌群组成,结果发现,随着转接次数的增加,微生物菌群的种类减少,在LB培养基中转接5次后优势菌群只有蜡状芽胞杆菌,而在MRS培养基中转接后优势菌群为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和类干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）。由此说明,微生物的营养基质和培养条件对微生态制剂在传代过程中的菌群组成和动态变化有重要影响。     

云台山白云岩表层土可培养细菌多样性

运用纯培养法和基于16S rRNA基因序列的系统发育分析贵州云台山白云岩表层土可培养细菌的多样性.稀释涂布平板分离共获得131株细菌,限制性内切酶HhaⅠ和HaeⅢ对扩增的16S rRNA基因片段进行酶切分型,根据ARDRA酶切图谱划分为40个操作分类单元.16S rRNA基因序列测定和系统发育分析结果显示,这些菌株隶属于包括厚壁菌门(Firmicutes,64.89%)、β-变形菌纲(β-Proterbacteria,3.82%)、γ-变形菌纲(γ-Proterbacteria,17.56%)、放线细菌门(Actinobacteria,11.45%)和拟杆菌门(Bacteroidetes,3.82%)等5大类群,共13个属.优势菌群为芽胞杆菌属(Bacillus,53.44%),亚优势菌群为寡养单胞菌属(Stenotrophomonas,9.16%)、假单胞菌属(Pseudomonas,8.40%)和微小杆菌属(Exiguobacterium,8.40%).15.00%的有效序列与GeneBank已知序列相似性小于等于97%,可能为潜在新类群.研究表明,云台山白云岩喀斯特地区不仅含有较为丰富的细菌物种多样性,且潜藏着许多新的微生物资源.     

分子生物学在微生物生态学中的应用

分子生物学方法正被广泛地用于微生物生态学研究。本文主要介绍了16SrRNA基因序列分析、变性梯度凝胶电泳与温度梯度电泳技术、限制性片断长度多态性技术、单链构象多态性分析、随机引物扩增多态性DNA等技术在微生物生态学中的应用。     

弧菌外膜蛋白OmpK免疫交叉反应性的分析

本研究旨在研究弧菌外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)OmpK免疫交叉反应的特征,探讨OmpK免疫交叉反应性的分子机制.利用克隆得到5株弧菌的ompK基因,通过比对10种(22株)弧菌的OmpK基因序列发现,ompK基因在弧菌中高度保守,其核苷酸序列的相似性达77%⁹3%.对副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)VPL4-90的ompK基因进行原核表达,利用纯化的OmpK重组蛋白,制备了兔抗OmpK血清.通过western blot分析发现,OmpK抗血清能够与16种不同的弧菌发生交叉识别反应,其中V.proteolyticus、V.furnissii、V.damsela和V.metschnikovii这4种弧菌OmpK的免疫交叉反应为首次报道,并且证实弧菌OmpK的免疫交叉反应具有种属特异性.通过抗原表位预测和比对发现,弧菌的OmpK具有8个保守的抗原表位,包括7个T细胞表位以及1个T细胞和B细胞的共同表位.流式细胞术分析显示,OmpK抗体能够识别这些相同或相似的抗原表位,提示这些抗原表位可能位于细菌表面.结果表明,这些保守的且位于细胞表面的OmpK抗原表位可能是弧菌OmpK具有免疫交叉反应性的分子基础.     

冰期天文理论的演变

冰期天文理论是运用地球轨道偏心率、地轴倾角和地转轴进动的3种参数的变化幅度与周期来解释上新世——第四纪期间冰期——间冰期交替变化的一种理论．该理论1842年由Adhemar提出, 经过Croll发展到Milankovitch最终完成,经历了整100年的时间。上世纪60年代开始,深海、黄土、冰芯等大量的地质记录都揭示出３种周期变化,从而证实冰期天文理论的正确性,同时也对冰期天文理论带来了一些概念上的修正．但是,Berger计算的天文曲线至少从6 Ma以来展示同一规律的变化,然而地质记录却显示清晰的分段响应模式:41 kyr的地轴倾角周期在5.3～1.4 Ma期间一直是记录曲线的主要特征;北半球冰川作用只是在2.7 Ma BP才开始大规模出现;0.8 Ma开始100 Ka周期转变为主要周期,称之为中更新世转型（MPT）．还有:11阶段和全新世是2个偏心率很低的时期,但记录中却是冰期——间冰期振幅最大的时期,即大的间冰期为何出现于低偏心时期;由间冰期进入冰期比由冰期进入间冰期时来的快,意味大冰盖建造需要很长的时间,而消融则比较迅速．这些都是冰期天文理论本身不能解释的问题,正在由地球响应系统的研究来探索答案．     

Goniurosaurus indet.的有效性及中国睑虎属(Squamata: Sauria: Eublepharidae)种间的亲缘关系

为了解我国睑虎属Goniurosaurus (Squamata: Sauria: Eublepharidae)种间的亲缘关系以及广东新纪录的睑虎属未定种Goniurosaurus indet.的有效性, 我们对睑虎属10个种的线粒体DNA基因片段进行比较和遗传变异分析. 获得12S rRNA (385 bp)和16S rRNA (477 bp)总长度为862 bp的联合序列, 共有核苷酸变异位点388个, 简约信息位点269个. 选取大壁虎Gekko gecko为外类群, 采用贝叶斯演绎法(BI)、最大似然法(ML)、最大简约法(MP)、邻接法(NJ)对两个基因联合序列的分析均显示相同结果, 即广东睑虎属未定种Goniurosaurus indet.与英德睑虎G. yingdeensis以及凭祥睑虎G .luii与蛛纹睑虎G. araneus两两种间的亲缘关系分别较近; 且分布区相邻的Goniurosaurus indet.与G. yingdeensis之间的遗传分化(遗传距离=0.044-0.046)相似于分类地位已经明确的G .luii与G. araneus种间的遗传差异(遗传距离=0.051). 结合前人的形态学研究结果, 我们认为Goniurosaurus indet.和G. yingdeensis之间已发生显著的遗传差异, 前者可能为睑虎属新种. 同时, 系统发育分析表明海南睑虎G. hainanensis与睑虎属其它物种之间的遗传分化较大, 系统发育地位最为特殊. 系统发育分析进一步表明具4条背部横纹是祖征, 具5条背部横纹为衍征. 我们的研究补充了睑虎科的基础资料, 为该属的系统发育研究和物种保护提供了一定的理论依据. 本文首次提出宽阔的河流可能是造成睑虎种群分化和新种形成的重要地理屏障. 这一“河流隔离”观点对全球睑虎属物种的亲缘地理分布格局的解释具有重要的理论意义.     

10种蔬菜内生细菌的分离筛选

以抑制植物主要病害病原菌和内生防病相关酶活性为评价标准,从蔬菜作物体内分离筛选植物内生细菌资源。从苦瓜、丝瓜、空心菜、大豆等10种蔬菜体内分离到101株细菌,发现内生细菌在不同种类的蔬菜中出现的频率不同,其中丝瓜叶上的内生细菌数量最多,洋葱体内分离到的内生细菌数量最少。运用平板对峙法从中筛选出了对黄瓜枯萎病菌、番茄青枯病菌、水稻细条病菌、荔枝霜疫霉病菌等有较强拮抗作用的菌株,获得对以上4种病菌均有拮抗作用的内生细菌有41株,占总株数的40．6％。对101株细菌进行纤维素酶、蛋白酶和几丁质酶活性测定表明,同时具有3种酶活性的菌株有32株,占总菌数的31．7％。从中选出13株拮抗效果较好的内生细菌。经初步鉴定均属于芽孢杆菌属（Bacillus sp）。进一步对筛选获得的同时对以上4种病原菌均有拮抗作用,且具有纤维素酶、蛋白酶和几丁质酶活性的13号、14号、59号和82号菌株进行16SrDNA序列分析,表明4个菌株均为枯草芽孢杆菌（B．subtilis）或其近缘种。     

3种色型仿刺参线粒体和核糖体序列片段遗传结构比较研究

仿刺参作为我国重要的海水养殖物种,良种选育是目前研究的重点,其中体色是重要的考虑因素之一。为了比较3种不同体色仿刺参的遗传结构,采用PCR扩增与测序技术对我国3种体色(青色、白色和紫色)仿刺参线粒体16S rRNA和COⅠ与核糖体18S rRNA-ITS-28S rRNA序列片段进行分析,揭示其遗传结构差异及系统发育关系。结果表明, 16S rRNA、COⅠ和18S rRNA-ITS-28S rRNA序列长度分别为812~830 bp、877~915 bp、1 536~1 572 bp。16S rRNA、COⅠ和18S rRNA-ITS-28S rRNA序列在青色、紫色和白色仿刺参中分别检测到单倍型个数分别为4/5/5、5/3/4和4/4/3, COⅠ序列多态性位点数目所比例最大, 16S rRNA序列最小。3种色型仿刺参16S rRNA、COⅠ和18S rRNA-ITS-28S rRNA序列遗传距离数值均比较小,范围分别为0~0.014 7、0~0.021 2和0~0.010 3,没有达到种的分化水平。以紫海胆为外群,基于COⅠ序列构建系统发育树,结果表明白刺参单独聚为一支,但是紫色和青色仿刺参不同个体间相互交叉聚集,无法通过发育树区分。     

SPF级实验小鼠4种致病菌多重PCR方法的建立及优化

目的 建立一种可同时检测4种SPF级屏障环境常见致病菌的多重PCR方法。方法 本研究针对鼠伤寒沙门氏菌invA基因、肺炎克雷伯杆菌khe基因、嗜肺巴斯德菌16SrRNA基因、铜绿假单胞菌ecfX基因序列分别设计合成特异性引物,构建可同时鉴别4种菌的多重PCR反应体系,优化后测定其特异性、灵敏性并人工模拟感染样本。结果 建立的4重PCR方法能对同一样品中的4种致病菌模板进行特异性扩增,无交叉反应;对4种目的菌的检测灵敏度为10-3ng/μL;也可从混合感染的病料中特异性地检测出4种致病菌。结论 本试验建立的多重PCR方法具有快速、简便、灵敏的特点,为4种致病菌的快速诊断和监控提供了有效的技术支持。     

新疆酸奶子中乳酸菌多样性分析

从15份采自新疆伊犁牧民家庭传统方法制作的酸奶子中分离出71株乳酸菌,并进行了生理生化表型特征鉴定。对其中的28株菌测定了16S rRNA基因全序列,构建系统发生树,结合生理生化结果,鉴定结果为,该酸奶子中乳酸菌涉及5个属、11个种及亚种,有些菌株对生长温度适应性较强。乳杆菌为新疆酸奶子中的优势菌属,以瑞士乳杆菌(Lb. helveticus)为最优势。     

16S rRNA基因技术在油藏微生物生态研究中的应用

分子生态学技术的发展大大促进了人们对环境中微生物群落的研究，也为研究油藏微生物群落和微生物采油技术提供了一个新的工具，尤其16S rRNA基因技术应用于油藏微生物生态研究．该技术克服了基于细胞水平研究方法的不足，能更准确、更客观地揭示油藏微生物的多样性、群落动态变化、种群结构及进化等方面的信息．文章简要综述了16S rRNA基因技术发展历程及在环境微生物生态学中的应用，详细概述了16S rRNA基因技术在油藏微生物生态研究中的地位和作用以及用于油藏微生物生态研究的16S rRNA基因技术，讨论了16S rRNA基因技术目前在油藏微生物生态研究中存在的问题，通过实例论证了该技术的现场应用效果，重点介绍了胜利油田利用T-RFLP、DGGE等分子生态学技术在河口采油厂罗801区块空气辅助微生物驱和单12区块内源微生物驱研究中的应用，阐明了分子生态学技术在微生物提高原油采收率研究中的重要的意义．