中国鲎β-actin基因的克隆与组织表达

中国鲎(Tachypleus tridentatus)是一种古老的海洋动物.利用RT-PCR和RACE等分子生物学技术,获得中国鲎β-肌动蛋白基因(中国鲎β-actin,简称为TTBA)全长cDNA序列,总共1 515bp,包括70bp 5′非编码区(untranslated regions,UTR)、314bp 3′UTR和一个1 131bp的开放阅读框(open reading frame,ORF).ORF可编码376个氨基酸残基,总分子质量约为41 807.7u.同源蛋白的序列比较结果显示,TTBA推导氨基酸序列与其他物种具有很高的相似性,推测β-actin基因具有很高的遗传保守性.而基于β-actin蛋白序列比对而绘制的系统进化树显示中国鲎与其他节肢动物具有较高的相似性,此结果与其现行的分类地位基本一致.以Real-time RT-PCR法检测表明,在卵子发生各期的卵巢组织中TTBA表达量保持稳定(p>0.05),可作为定量检测的内参基因.     

日本三角涡虫肠上皮的超微结构

用透射电镜镜研究了日本三角涡虫(Dugesiajaponica)肠上皮的超微结构,结果表明:肠上皮由两类细胞构成,一类为电子密度高深染的细胞,另一类为电子密度低浅染的细胞;深染的细胞没有突向肠腔,内有大小不一的未着色和深染的囊泡;浅染的细胞游离面呈不规则样突向肠腔,也含有很多大小不一的未着色和浅染的囊泡;浅染的细胞中可...     

日本三角涡虫单克隆群体的繁殖技术

日本三角涡虫是扁形动物门涡虫纲的代表动物,其独特的结构和极强的再生能力在研究胚胎发育和细胞分化中受到重视。但作为实验材料其个体较小,要取得足够量的组织存在困难,是研究工作中存在的问题。由于涡虫在受伤或被截断后,可以依赖体内的副胚层干细胞完整再生,因此,利用人工切割和饲养的方法可以培养大量的单克隆涡虫品系。研究目的在于建立涡虫单克隆群体的养殖体系标准,为后续的基因组和蛋白质组研究工作提供了依据。     

日本三角涡虫染色体和分子分类特征研究

日本三角涡虫是国际上研究涡虫再生和发育的模式动物,三角涡虫传统的分类学基础是以其生殖解剖学特征为依据.通过核型分析和RT-PCR技术,从核学和分子生物学水平对三角涡虫的分类学特征进行研究,结果表明:染色体和分子分类特征可以有效地辅助三角涡虫的分类.     

Djhsp70-4基因在日本三角涡虫中的功能分析

热休克蛋白70(HSP70)在细胞保护等方面起着关键作用,但至目前为止,在日本三角涡虫(Dugesia japonica)中,HSP70的具体功能尚不明确.以再生能力极强的日本三角涡虫为实验材料,从转录组数据库中筛选了在再生过程中显著调高的Djhsp70-4基因进行研究.实时荧光定量PCR结果显示:在受到外界刺激后,Djhsp70-4基因的表达量显著上调.通过整体原位杂交技术,观察到Djhsp70-4基因在整体涡虫身体两侧及再生芽基处有较强的杂交信号.利用RNA干扰技术敲低Djhsp70-4基因的表达量后,整体及再生组涡虫出现头部溶解现象.综上所述,Djhsp70-4基因可能在日本三角涡虫的稳态维持以及再生方面发挥重要作用.     

温度对日本三角涡虫眼点再生速度的影响

将耳突后切割去头的日本三角涡虫(Dugesia japonica)分别置于16℃、18℃、20℃、22℃、24℃、26℃和28℃条件下培养,在体视显微镜下观察不同温度条件下眼点的再生情况,发现日本三角涡虫眼点再生的最适温度是22℃.通过石蜡切片对22℃培养的涡虫眼点的再生情况进行组织学研究,结果表明:涡虫去头培养第3d新生组织基部分化出视色素细胞团,随着再生进程视杯逐渐变大.     

日本三角涡虫组织结构嗜银反应观察

涡虫在动物系统演化史上占有十分重要的地位,雌雄同体,具有很强的再生能力,因此,对其组织结构嗜银反应进行研究具有重要的意义.本文用Grimellus还原银法显示了日本三角涡虫(Dugesia japonica)嗜银反应阳性的组织结构.结果表明:肠上皮细胞内有很多染成棕褐色的圆形泡状结构,肠上皮下的实质组织细胞中分布很多黑色颗粒;交配囊上皮细胞可见染成棕褐色的颗粒;在雄腔和交配囊柄两侧和后部可见染成棕褐色的三角形区域;纵神经索嗜银反应较弱,呈浅褐色.因此,可以确定肠上皮下实质组织中存在APUD系统.     

河南两产地日本三角涡虫的染色体和核型多样性分析

利用空气干燥法对采自河南省桐柏县西小河和三里岔村两产地日本三角涡虫(Dugesia japonica)的染色体和核型进行了研究,结果表明:日本三角涡虫西小河种群的体细胞中染色体数目以16条为主,少数为24条和25条,分别占86.67%、6.07%和7.26%,染色体基数为8,为2倍体、3倍体和3倍性非整倍体的混合体,核...     

不同烃链长度咪唑类离子液体对日本三角涡虫的急性毒性

采用SPSS软件概率单位法研究了4种不同烃链长度的咪唑类离子液体对日本三角涡虫的急性毒性.结果表明:[C4mim]Br,[C6mim]Br,[C8mim]Br和[C10mim]Br对日本三角涡虫72h、96h的半数致死浓度(LC50)分别为2 079.46和1 744.38mg·L-1,919.35和725.00mg·L-1,312.79和238.50mg·L-1以及32.57和23.25mg·L-1.由LC50值的大小可知,4种不同烃链长度的咪唑类离子液体的毒性[C10mim]Br>[C8mim]Br>[C6mim]Br>[C4mim]Br.由此可见,咪唑类离子液体对涡虫的急性毒性大小与其烷基侧链长度密切相关,碳链越长毒性越大.此外,根据急性毒性试验涡虫的中毒症状,也就离子液体对涡虫可能的靶器官问题进行了初步探讨.     

日本三角涡虫Dj-β-catenin-1基因干扰载体的构建与干扰效果的鉴定

为了研究抑制Dj-β-catenin-1基因对涡虫再生的影响,构建了L4440-Dj-β-catenin-1干扰载体.将含有重组质粒L4440-Dj-β-catenin-1的HT115细菌经IPTG诱导后直接喂食涡虫.结果表明,Dj-β-catenin-1基因经RNA干扰后涡虫不能正常再生,面向后端伤口再生出一个头部而不是尾.此外,Dj-β-catenin-1基因的沉默还能使涡虫正常的尾转变成头.上述工作为进一步研究Dj-β-catenin-1基因在日本三角涡虫再生中的作用奠定良好基础.     

温度对日本三角涡虫种群增长及抗氧化酶活力的影响

应用种群累积培养法,就培养液温度对日本三角涡虫种群增长及体内3种抗氧化酶活力的影响进行了探讨.结果表明,5℃和35℃下的涡虫不能长期生存.30 d时25℃实验组种群密度最高、20℃实验组次之;第9 d后15℃-30℃实验组涡虫种群瞬时增长率随时间的推移均呈现逐渐下降的趋势.另外,10℃-20℃实验组涡虫SOD活力较其他实验组低,而15℃实验组涡虫CAT活力却较其他实验组高;GSH-PX活力受培养液温度的影响明显且波动较大,随着培养液温度的升高其活力总体呈现增加趋势.涡虫的SOD、CAT和GSH-PX 3种抗氧化酶对培养液温度变化的响应存在差异的机制值得进一步探讨.     

三角涡虫雄性生殖管道的观察

涡虫在动物系统演化史上占有十分重要的地位,雌雄同体,具有很强的再生能力,因此,对其生殖系统组织结构进行深入研究具有重要的意义.本文用2种染色方法(H.E染色、Masson染色)显示了日本三角涡虫(Dugesia japonica)雄性生殖管道的组织结构并对其进行了光镜观察.结果表明,该类涡虫雄性生殖管道是由输精囊、输精管、球腔、射精管4部分构成.     

鸭β-actin基因实时荧光定量PCR方法的建立

根据GenBank中鸭β-actin基因的序列,在保守区域设计并合成一对引物,采用SYBR G reen I染料建立了荧光定量PCR法(real-tim e PCR).以PCR产物建立标准曲线,C t值线性范围为12.2~35.1,相关系数为0.996;熔解曲线分析显示产物为单特异峰,Tm为86.5±0℃.本实验建立的鸭β-actin基因实时荧光定量PCR法扩增效率高、线性范围广、检测周期短,为β-actin基因作为内参基因进行鸭功能基因与病原基因表达的定量分析奠定了基础.     

东亚三角涡虫新基因Dj_UF-1功能分析

为进一步完善东亚三角涡虫(Dujesia japonica)基因数据信息,对东亚三角涡虫新基因Dj_UF-1进行生物信息学分析和表达水平检测.分析结果显示,该基因包含450bp的开放阅读框,编码149个氨基酸,Dj_UF-1蛋白分子量为17 179.8D,等电点为8.03.蛋白质三级结构预测发现Dj_UF-1与LYNX 1相似度较高.实时定量PCR结果表明,Dj_UF-1基因在东亚三角涡虫头部的表达量高于其在尾部的表达量.推测Dj_UF-1基因是东亚三角涡虫神经系统相关基因,Dj_UF-1为类LYNX 1蛋白.     

中国淡水三角涡虫种群间的亲缘关系分析

利用RAPD分子标记技术对中国8个产地淡水三角涡虫种群进行亲缘关系分析．筛选出13个合适的随机引物对8产地涡虫种群基因组进行PCR扩增,共产生137个扩增片段,平均每个引物扩增出10．5个片段,片段大小在3002000bp之间．不同涡虫种群间遗传距离变化较大,种群间最大遗传距离为0．4818,最小遗传距离为0．0876,平均遗传距离为0．3845;UPGMA法聚类分析表明：8产地涡虫种群可聚为3个聚类群,其中贵州遵义凤凰山和江苏太湖东山岛的涡虫种群间亲缘关系最近,安徽合肥龙泉山的涡虫种群与其他产地种群的亲缘关系最远．本研究表明上述8产地三角涡虫种群有明显的遗传分化,且种群间的亲缘关系与地理距离没有显著相关性．     

Pb^2＋对日本三角涡虫急性毒理作用及其6种酶活力的影响

通过急性毒理实验,观察了Pb2+对日本三角涡虫(Dugesia japonica)的损伤状况,并探讨了Pb2+对涡虫体内LDH、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶等3种代谢酶和SOD、CAT和GSH-PX等3种抗氧化酶活力的影响.Pb2+对涡虫的24h、36h、48h急性毒理作用半致死浓度(LC50)分别为685.1μmolL-1、402.8μmolL -1、279.2μmolL-1;结果还显示Pb2+浓度越高涡虫的致死时间越短,在相同时间内随着Pb2+浓度的升高涡虫死亡率也随之升高,并且随着Pb2+处理时间的延长涡虫死亡率与培养液中Pb2+浓度的正相关性逐渐提高.另外,Pb2+胁迫对涡虫体内6种酶的活力均有明显的影响.结果表明,日本三角涡虫是一种对Pb2+污染非常敏感的低等动物,在水体Pb2+污染检测等方面具有潜在价值和应用前景.     

东亚三角涡虫innexin基因干扰载体的构建

为了明确innexin基因沉默后对涡虫表型的影响,构建了涡虫innexin基因的干扰表达重组质粒L4440-innexin.将重组载体转化入大肠杆菌HT115感受态细胞,通过IPTG诱导表达后喂养涡虫.结果表明,涡虫表型发生明显变化,干扰载体构建成功.     

DjRock2参与东亚三角涡虫再生调节

利用体外转录的方法合成DjRock2基因的RNA探针,检测RNA探针效率后,对成体及再生过程中的涡虫进行原位杂交试验;将DjRock2基因插入到L4440载体中,构建L4440-DjRock2干扰载体,合成dsRNA并微注射涡虫,利用RT-PCR和Western blot技术检测干扰后再生过程中DjRock2 mRNA和蛋白表达的下调作用。结果表明:DjRock2基因在成熟涡虫中枢神经系统中特异性表达,再生过程中伤口处胚基位置有阳性信号;干扰成体涡虫在再生第3天,头部、中部、尾部都有胚基的形成,但是第5天开始伤口处细胞凋亡,成体干细胞没有完成正常的分化,头部、中部、尾部再生都受到抑制,不能正常完成再生,甚至死亡。RT-PCR技术检测到RNA干扰后DjRock2mRNA的表达显著下降。Western blot检测到干扰后DjRock2蛋白的表达下调。所构建的L4440-DjRock2干扰载体干扰效率高,表型变化明显,从基因和蛋白方面进行分析,为进一步研究Rock2基因的功能奠定了基础。     

离子液体溴化1-辛基-3-甲基咪唑对日本三角涡虫摄食与再生的影响

测定了离子液体溴化1-辛基-3-甲基咪唑对日本三角涡虫的急性毒性,并在此基础上研究了离子液体曝露对日本三角涡虫摄食与再生的影响.结果表明,离子液体对涡虫72h的LC50为313mg·L-1.在摄食实验中,离子液体处理组的摄食涡虫数均较对照组有不同程度的下降,且质量浓度20mg·L-1时,摄食涡虫数在3次喂食后的不同时间点大多明显减少,与对照组相比差异显著.在再生实验中,前96h各处理组的再生涡虫数均较对照组少,且质量浓度20mg·L-1的3个处理组与对照组相比差异显著.由此可见,离子液体对涡虫的摄食和再生均有一定的抑制作用,且该影响具有剂量——效应关系.此外,本文也对离子液体影响涡虫摄食、再生的可能机制进行了初步探讨.     

日本血吸虫体壁抗原基因的筛选与克隆

为筛选并克隆新的日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)候选抗原基因,以日本血吸虫成虫总DNA为模板,通过生物信息学以及分子生物学手段从日本血吸虫全基因组中筛选目的基因.根据所筛选到的目的基因的核酸序列设计合成引物,用PCR法扩增目的基因,将其克隆入pBS-T载体后转入到大肠杆菌DH5a菌株,筛选阳性克隆.通过对阳性菌落质粒进行PcR予以证实.最终成功筛选并克隆到日本血吸虫体壁候选抗原基因.