珠眉海棠（Malus zumi Mats）盐应答MzDREBb基因的克隆与功能研究

通过microarray（微列阵芯片）分析,从珠眉海棠盐胁迫cDNA文库中分离得到盐诱导的MzDREBb基因全长cDNA序列,研究苹果属植物DREB转录因子在胁迫中的作用。结果表明：MzDREBb全长1 185bp,开放阅读框共714bp,5′-UTR和3′-UTR的长度分别是121和350bp;MzDREBb编码237个氨基酸,有一个AP2/ERF结构域;系统分类将MzDREBb归入DREB家族的A-5亚组;MzDREBb定位在细胞核中,具有转录激活活性;半定量RT-PCR表明MzDREBb基因受到盐诱导。超表达MzDREBb基因的拟南芥耐盐能力增强。以上结果表明MzDREBb基因在盐胁迫应答中起重要作用。     

油菜MAP激酶基因BnMPK6基因的克隆及表达分析

从陇油6号油菜中克隆得到了一种新的MAP激酶基因BnMPK6,全长1521 bp,其中包括1185 bp的开放阅读框,81 bp的5′非翻译区(5′UTR),255 bp的3′非翻译区(3′UTR).与拟南芥AtMPK6同源性达86.9%,因此命名为BnMPK6(GenBank登录号为HQ156228).该基因编码394个氨基酸的蛋白质,分子量44.8 kDa,等电点为5.13.实时荧光定量PCR结果表明该基因表达量随着低温胁迫时间的增长而增高,说明BnMPK6基因受低温胁迫诱导表达.     

四膜虫有性生殖过程中特异表达基因TCD3的序列分析

含有CHROMO(chromatin organization modifier)结构域的蛋白参与了染色质结构的调节.本研究从嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)全基因数据库(www.ciliate.org)和基因表达数据库(tged.ihb.ac.cn)中筛选到有性生殖特异表达TCD3(Tetrahymena chromo domain-containing protein 3)基因.该基因ORF为1 005bp,大核染色体中基因全长1 241bp,含有两个内含子.5′-RACE和3′-RACE表明5′端非编码区(5′-UTR)长度为40bp,3′端非编码区(3′-UTR)长度为90bp.TCD3基因预测编码334个氨基酸构成,含有一个CHROMO结构域.CHROMO结构域聚类分析表明四膜虫Tcd3蛋白可能与线虫CeCDP功能类似,参与异染色质的形成和DNA序列删除.     

斜带石斑鱼肝脂酶和脂蛋白脂酶基因克隆与序列分析

为从分子水平研究海水鱼类肝脂酶(hepatic lipase,HL)和脂蛋白脂酶(liportein lipase,LPL)基因在脂质代谢过程中的作用及其分子系统进化地位,采用RT-PCR及RACE法从斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)肝脏克隆得到HL、LPL基因cDNA全序列.克隆获得斜带石斑鱼肝脏HL基因cDNA全长2 261 bp,其中5′非翻译区(5′-UTR)为186 bp,3′-UTR为590 bp,开放阅读框(ORF)为1 485 bp,编码494个氨基酸;LPL基因cDNA全长2 191 bp,其中5′-UTR为 144 bp,3′-UTR为 499 bp,ORF为1 548 bp,编码515个氨基酸.序列同源性分析表明,斜带石斑鱼HL、LPL基因与哺乳动物同源性均低于真骨鱼类罗非鱼、斑鳢和真鲷等,这与其亲缘远近关系相一致,表明HL、LPL在进化过程中都相对保守.构建系统发生树显示,斜带石斑鱼HL、LPL基因氨基酸序列与大口黑鲈、真鲷等共同占据进化树上独立的分枝,与较为原始的硬骨鱼类中华鲟在进化树上距离较远.本实验对斜带石斑鱼HL、LPL基因同源性、系统进化地位的研究,为进一步研究海水鱼类脂代谢调控机制,预防鱼类脂代谢疾病奠定了基础.     

豌豆cop1 cDNA的克隆、序列分析及其在大肠杆菌中的表达

以拟南芥cop1 cDNA为探针,从豌豆(Pisum sativum) cDNA文库中克隆到了豌豆cop1 cDNA。序列分析表明,它全长为2863bp,其中包括604bp 5′非编码区、243bp 3′非编码区和2016bp编码区,编码672个氨基酸。在大肠杆菌中实现了豌豆cop1基因的高效表达。对拟南芥、豌豆和番茄3种植物cop1的序列同源性比较表明,cop1可能是一种进化上很保守的蛋白质。     

甘蓝型油菜BnBRI1基因的克隆及表达分析

以拟南芥油菜素内酯受体BRI1基因序列设计同源简并引物,利用同源克隆技术,克隆了甘蓝型油菜中编码油菜素内酯受体基因全长cDNA序列,命名为BnBRI1(GenBank:JX871217),该基因开放阅读框(ORF)大小为3591bp,与拟南芥中BRI1基因(GenBank:NM_120100)相似性为94.21%,编码1196个氨基酸,与拟南芥中BRI编码的氨基酸相似性为89.23%.采用实时定量PCR分析表明,BnBRI1基因在根、茎、叶中都有表达,但表达量存在显著差异.在两叶一心期和花期的根中表达量最高,四叶一心期和抽薹期的叶中表达量最高.     

甘蓝型油菜BnFAD8基因编码序列的克隆和表达谱分析

通过比对拟南芥等同源基因,克隆了甘蓝型油菜FAD8基因中的保守序列.以得到的FAD8（Fatty Acid Desaturase 8）保守序列片段为信息探针,在GenBank的EST数据库中检索高度同源的EST,并通过人工拼接及RTPCR得到油菜该基因的全长为1299 bp的cDNA序列,命名为BnFAD8.序列分析结果中发现该基因符合质体定位的ω3脂肪酸脱饱和酶序列特征.通过比较22 ℃和8 ℃处理的甘蓝型油菜的BnFAD8基因表达谱,发现该基因在常温下仅存在痕量表达;而在低温条件下在叶中表达出现     

佛手GRAS基因的克隆及表达分析

利用抑制消减杂交法从芸香科柑橘属不耐寒植物佛手中分离得到了一个表达序列标签(EST)片段,结合RACE技术克隆获得该基因的1 669 bp序列,编码区长1 236 bp,编码413个氨基酸.通过Blastn同源序列比对分析,结果显示该基因与拟南芥已知的GRAS基因同源性较高;与GenBank数据库比对分析,表明该基因具有GRAS特有的保守结构域.因此,命名该基因为:CmsGRAS(GenBank登录号:JF440647).用荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)的方法研究了该基因在低温胁迫处理下的表达特性,结果显示该基因在低温胁迫后的表达量有明显的变化.     

诸葛菜EPSPS基因5′端的克隆和序列分析

烯醇式丙酮基莽草酸 3 磷酸合成酶(5 enolpyruvylshikimate 3 phosphatesynthase,EP SPS)是植物和微生物莽草酸途径中的一个必需合成酶,植物中该基因的超量表达或该基因中某些氨基酸突变可以产生对除草剂草甘膦(glyphosate)的耐性.采用5′ RACE技术从诸葛菜(Orychophragmusviolaceus)叶中克隆出一条长743bp的cDNA片段.序列分析结果表明:该cDNA与其它植物的EPSPS基因具有相当高的核苷酸序列同源性.其所编码的氨基酸序列与欧洲油菜(Brassicanapus)同源性最高为90%,与拟南芥(Arabidopsisthaliana)、玉米(Zeamays)、西红柿(Lycopersiconesculentum)、烟草(Nicotianatabacum)和水稻(Oryzasativa)的同源性分别为88%,81%,64%,62%和71%.     

甘蓝型油菜BnDHAR基因的克隆及表达分析

在甘蓝型油菜矮化突变体与其高秆亲本构建的消减杂交文库中,得到一长约230bp与编码脱氢抗坏血酸还原酶的DHAR基因核苷酸序列相似的DNA片段.采用同源克隆技术,在甘蓝型油菜中获得该基因的全长cDNA序列,命名为BnDHAR.BnDHAR与已公布的甘蓝型油菜基因组中的该基因核苷酸序列完全一致.对BnDHAR基因不同发育时期组织的表达分析的结果显示,BnDHAR基因在高秆油菜苗期的叶中表达量最高,是矮化突变体的5倍,在根、茎中表达极低,具有组织特异性.非生物胁迫显著影响BnDHAR表达,高温胁迫使其表达升高,盐胁迫处理9h时达最高,而干旱胁迫时表达量在处理12h时才达最高.     

油菜BnRCH基因提高转基因拟南芥的耐盐性研究

为探索本实验室从甘蓝型油菜中克隆到的BnRCH基因在植物耐盐中的作用,比较了NaCl胁迫下转基因与野生型拟南芥在萌发及幼苗生长的差异.结果表明:在100 mMNaCl处理下,BnRCH转基因拟南芥种子萌发率比野生型高3～5倍;盐胁迫后野生型拟南芥幼苗首先表现出枯萎、白化现象;除去盐胁迫后,转基因拟南芥幼苗恢复生长状况明显优于野生型.本实验结果表明BnRCH基因能够提高转基因拟南芥的耐盐性.     

日本囊对虾Na-K-2Cl共同转运蛋白基因的克隆与组织表达分析

利用反转录PCR(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)等技术在鳃组织中获得日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)Na-K-2Cl共同转运蛋白(NKCC)cDNA全序列,包含14bp的5′非编码区(5′-UTR)、201bp的3′-UTR和3 183bp的开放阅读框(ORF).该ORF共编码1 060个氨基酸,预测蛋白分子质量为117.051ku,理论等电点为6.57,命名为Mj-NKCC.预测Mj-NKCC二级结构由10个跨膜区组成,跨膜区的氨基酸序列和布局均相对保守.同源对比结果显示,Mj-NKCC的氨基酸序列与夏威夷海蚀洞虾(Halocaridina rubra)的Na-K-2Cl共同转运蛋白相似度最高,为77%.系统进化分析表明Mj-NKCC与夏威夷海蚀洞虾、蓝蟹(Callinectes sapidus)等甲壳动物的NKCC聚为一支.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析表明,Mj-NKCC基因在肝胰腺、鳃、胃、肠、心、眼柄、肌肉和血细胞中均有表达,鳃组织中表达量最高;在盐度骤变时,该基因表达变化显著,表明其很可能参与了对虾的渗透压调节,在对虾的渗透平衡中发挥重要作用.     

水稻胁迫应答基因OsABI8的克隆与表达分析

利用拟南芥abscisic acid-insensitive8(ABI8)基因的序列在NCBI核酸数据库中检索到水稻ABI8的序列信息,并设计特异性引物,以水稻cDNA为模板,利用RT-PCR技术,扩增出水稻ABI8 cDNA序列.将所得序列片段克隆到T载体上并进行序列测定,结果显示,该基因全长1 666 bp,开放阅读框927 bp,编码一个308个氨基酸的蛋白.该蛋白序列与普通小麦、一粒小麦、玉米、高粱、拟南芥菜等植物的ABI8基因序列高度同源,分别达到86.1%、86.4%、89.6%、90.3%及72.5%的一致性.利用荧光定量PCR法检测了QsABI8基因在ABA激素、干旱和盐胁迫下的表达谱,发现胁迫下植物积累更多的QsABI8 mRNA.     

非生物胁迫下小麦TaGAPCp1基因启动子的功能分析

探究质体形式的GAPCp (Plastidial glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)基因启动子响应干旱、盐和外源ABA等非生物胁迫的机理.首先从中国春小麦中克隆得到TaGAPCp1基因上游1 985 bp的核苷酸序列,经Plant CARE数据库分析表明,该启动子含有众多防御和逆境响应元件(defense and stress-responsive ele-ments,DSREs),激素响应元件(hormone-responsive elements,HREs)和光响应元件(light-responsive ele-ments,LREs).从小麦数据库下载Ta GAPCp亚家族基因启动子序列,序列对比分析表明,该亚家族成员启动子上功能元件种类相近但数量相差较大.构建含TaGAPCp1基因启动子的表达载体,通过农杆菌介导法转化烟草并进行ABA (100μmol·L~(-1))、PEG8000 (20%)、Na Cl (250 mmol·L~(-1))和4℃低温处理,组织化学染色显示TaGAPCp1基因启动子能驱动GUS基因的表达但活性明显低于Ca MV35S,GUS活性分析显示TaGAPCp1基因启动子能响应非生物胁迫.通过农杆菌介导的浸花法转化拟南芥,经潮霉素和羧苄青霉素筛选及叶片PCR检测,最终获得稳定遗传的转基因拟南芥20株,并得知转基因拟南芥中的GUS基因能被干旱胁迫显著诱导表达.     

甘蓝型油菜CCCH基因BnaA07g26050D的克隆及表达分析

油菜是我国重要的油料作物,它的产量受到各种逆境胁迫的影响.我们之前的研究表明,拟南芥CCCH锌指蛋白At C3H14控制植株生长发育的诸多过程.在本研究中,我们证实甘蓝型油菜CCCH基因Bna A07g26050D(At C3H14的同源基因)响应盐胁迫和干旱胁迫.Bna A07g26050D蛋白C端包含两个串联的CX8CX5CX3H结构域,在酵母中具有转录激活活性,类似于At C3H14.将Bna A07g26050D融合GFP转化拟南芥原生质体,发现其主要定位于细胞质和P-body中.qRT-PCR检测Bna A07g26050D基因的组织表达模式,结果表明该基因主要在上部茎、根和花中大量表达,而在其他组织中表达较低.此外,qRTPCR证实Bna A07g26050D基因在盐胁迫和干旱胁迫下表达量都明显上调,证明该基因可能参与干旱和盐胁迫.我们的研究为利用基因工程技术培育耐盐、旱油菜新品种提供了基因源.     

甘蓝型油菜BnbHLH92基因的克隆与表达分析

为研究甘蓝型油菜bHLH转录因子的功能,采用同源克隆技术从甘蓝型油菜中克隆了5个BnbHLH92基因全长cDNA序列,分别命名为BnbHLH92-1、BnbHLH92-2、BnbHLH92-3、BnbHLH92-4、BnbHLH92-5,其编码区长度分别为738,657,684,741,717bp.qRT-PCR实验表明,除BnbHLH92-1外,其它的BnbHLH92基因主要在抽薹期和花期的根中表达,BnbHLH92-1主要在抽薹期和花期的根以及二叶一心期的叶中表达.非生物胁迫显著影响BnbHLH92基因的表达,使其表达量升高.低温胁迫下,BnbHLH92基因分别在胁迫后4、6、6、6、6 h表达量达最高.高温胁迫下,5个BnbHLH92基因分别在胁迫后2、6、6、8、4 h表达量达最高.盐胁迫下,BnbHLH92基因分别在胁迫后6、6、24、24、24 h表达量达最高.在ABA诱导下BnbHLH92基因表达量也有不同程度的增加,分析发现BnbHLH92基因的启动子序列上存在ABA响应元件(ABRE).     

桃树抗寒相关的叶绿体新基因PpRBD1的克隆及特征分析

为确定桃树细胞质抗寒相关基因,依据模式植物拟南芥中抗寒相关的RBD1基因,结合桃基因组数据设计并克隆到一个桃PpRBD1基因。该基因全长2 230 bp,编码513个氨基酸;结构域分析显示,该氨基酸序列含有RRM(RNA recognition motif)保守结构域,是与拟南芥RBD1同源的蛋白;亚细胞定位预测表明,该基因编码的蛋白可能在叶绿体中表达。该基因可能在桃抵抗寒冷胁迫中发挥重要作用。     

盘羊与巴什拜羊杂交后代SPLUNC1基因克隆及序列分析

为了克隆盘羊与巴什拜羊杂交后代短鄂、肺及鼻咽上皮细胞克隆1(SPLUNC1)基因cDNA全长序列,本研究根据GenBank上已公布的牛、山羊的SPLUNC1基因序列来设计简并引物,以盘羊与巴什拜羊杂交F1代为材料,克隆出盘羊与巴什拜羊杂交后代SPLUNC1基因的片段序列,再利用RACE法克隆其SPLUNC1基因3′端和5′端,测序后拼接获得SPLUNC1基因全长cDNA序列。结果显示,盘羊与巴什拜羊杂交后代SPLUNC1基因的cDNA全长为1117 bp,5′非编码区(UTR)为84 bp,3′UTR为265 bp,开放阅读框(ORF)为768 bp,编码255个氨基酸。预测该基因编码蛋白的等电点5.006,分子量26.57 kDa。系统进化分析表明,盘羊与巴什拜羊杂交后代SPLUNC1氨基酸序列与绵羊的氨基酸序列同源性最高。本研究克隆了盘羊与巴什拜羊杂交后代SPLUNC1基因全长cDNA序列,为后续深入研究该杂交后代SPLUNC1基因的功能奠定基础。     

人Oligophrenin 1样(OPHN1L)基因的克隆

将人Oligophrenin 1(OPHN1)基因编码区2406 bp与EST数据库进行同源性分析,得到一个363 bp的EST AA035622与OPHN1基因编码区一致性为62%,该EST与一个cDNA序列AB014521完全匹配.在ABO14521中设计引物与cDNA文库载体臂上引物行巢式PCR扩增并进行5′RACE,在胎盘cDNA文库中获得cDNA序列606bp,与AB014521拼接成一个6906 bp的cDNA序列,其中包含一个2442 bp的开放阅读框,编码813个氨基酸.该cDNA序列的GenBank登录号为AF141884,并经GDB命名委员会命名为OPHN1L基因.OPHN1L基因3′端与大规模测序的BAC克隆AC005348及AC004782完全匹配,从而将该基因定位于5q21.2～q21.3,并由此获得它的部分基因组结构.     

小拟南芥激素相关基因及GH3.6的克隆与表达

植物激素是植物体内产生的一些微量的、能调节自身生理过程的有机化合物,生长素是一种重要的植物激素,在植物生长发育的过程中起着重要作用。为了探索激素相关基因在短命植物小拟南芥(Arabidopsis pumila)逆境适应过程中的作用,本研究基于小拟南芥响应高盐胁迫叶片转录组数据库,首先筛选出2156个激素相关基因,包括生长素、脱落酸、乙烯、水杨酸、茉莉酸、油菜素内酯、细胞分裂素及赤霉素相关的基因,其中生长素和脱落酸相关基因所占比例最多并且多为上调表达。进一步通过分层聚类(H-Cluster),K均值聚类(K-means Cluster)和密度聚类(SOM Cluster)分析持续上调的基因,发现一个编码吲哚乙酸酰胺合成酶的基因GRETCHEN HAGEN 3. 6(GH3. 6)在高盐胁迫过程中明显上调表达。采用RT-PCR克隆小拟南芥Ap GH3. 6基因,其开放阅读框长为1839 bp,编码612个氨基酸。系统进化分析表明,Ap GH3. 6与山"菜(Eutrema salsugineum) GH3. 6进化关系最近,属于同一进化分支。转录组数据分析表明在250 m M Na Cl下,Ap GH3. 6持续上调表达;实时荧光定量PCR分析表明Ap GH3. 6在小拟南芥各个组织中均有表达,但在花中表达量最高;高盐胁迫表达分析表明,随着胁迫时间增加,Ap GH3. 6表达量不断升高。为了进一步研究该基因的功能,构建了植物过量表达载体35S∶Ap GH3. 6并转化农杆菌GV3101。本研究为深入分析激素相关基因在小拟南芥响应盐胁迫中的功能机制奠定了基础。