牛蛙生长激素基因cDNA克隆及在大肠杆菌中的表达

以成体牛蛙脑垂体总RNA为模板进行RT-PCR,克隆到牛蛙生长激素基因(bullfrog growth hormone, bfGH)cDNA编码序列,其长度为651 bp,编码的前体GH蛋白序列经BLAST分析,与已报道的牛蛙GH蛋白质序列AAB24792、AAB19428、CAA31038的同源性分别为98.1%、96.3%、95.3%,其在Genbank的登录号为AY251538;将bfGH亚克隆到原核表达载体pGEX1-λt构建成牛蛙GH原核表达载体VGBfGH,转化BL21（DE3）E.coli得     

草鱼生长激素基因的克隆及原核表达研究

应用RT-PCR技术从草鱼脑垂体总RNA中克隆草鱼生长激素cDNA(cGH)，全长669bp，含开放阅读框633bp，编码210个氨基酸，分子量为23．6kDa，等电点为6．28；与已报道的草鱼GH有12个碱基、3个氨基酸残基的差异，同源性为98％．将草鱼cDNA定向插入原核表达载体pGEX-4T-1，构建了重组草鱼GH基因质粒pGEX-GcGH，经IPTG诱导，pGEX-GcGH在大肠杆菌中可表达49．6kDa的融合蛋白．     

氧化葡萄糖杆菌ddsA基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

聚十异戊烯焦磷酸合成酶催化异戊烯二磷酸与丙烯基二磷酸发生连续的综合反应生成聚十异戊烯焦磷酸，构成辅酶Q10的侧链。将氧化葡糖杆菌（Gluconobacter oxydans）的染色体DNA用EcoRI酶切，回收50kb左右的片段为模板，通过PCR扩增得到了聚十异戊烯焦磷酸合成酶基因（ddsA）。测序分析表明该基因有一个951bp的开放型阅读框架，氨基酸序列与其他聚戊烯焦磷酸合成酶具有高度同源性（30％－50％）。将ddsA基因克隆到pUC19载体上得到pUC－GZH表达质粒，将其转入大肠杆菌JM83宿主，经IPTG诱导表达融合蛋白，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）的37ku处出现相应的条带。     

大肠杆菌NADP特异性谷氨酸脱氢酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达与纯化

谷氨酸脱氢酶是生物体内最主要的氧化脱氨基酶类，为了进一步研究其功能，我们以大肠杆菌DH5α菌株基因组DNA为模板和相应的寡聚脱氧核苷酸为引物，进行PCR扩增大肠杆菌NADP特异性谷氨酸脱氢酶基因(NADP-specific glutamate dehydrogenase，gdhA gene)，将所得DNA片断连接到质粒pUC18上，转化大肠杆菌DH5α，进行蓝白筛选和酶切鉴定，经测序证明序列正确无误后将gdhA基因连接到表达载体pTrcHisC上，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，经SDS-PAGE和双波长扫描分析，确定大肠杆菌谷氨酸脱氢酶在大肠杆菌中表达时以包涵体的形式存在，未能检测到可溶性蛋白的表达，表达量可达菌体总蛋白的15％以上．     

纳豆激酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

纳豆激酶是一种良好的天然蛋白酶类溶栓物质。国内外许多学者对该酶进行了基因工程研究,但在克隆表达过程中出现了许多长短不同的基因片段。本研究通过原产日本的优质纳豆中分离鉴定出高产纳豆杆菌N07并提取该菌株的全基因组;通过PCR手段扩增出能编码纳豆激酶信号肽,前导肽和成熟肽的前纳豆激酶酶原基因NK1,以及能编码纳豆激酶成熟肽的纳豆激酶基因NK2,构建了纳豆激酶基因的表达载体pET30a-NK1和pET30a-NK2,转化E.coli BL21后在大肠杆菌中表达,并进行了活性分析。结果发现,纳豆激酶酶原基因片段NK1能成功表达出有活性的分泌型纳豆激酶;而纳豆激酶基因片段NK2的表达产物为无活性的包涵体。在对NK1和NK2的比较研究后可知,纳豆激酶酶原基因片段NK1能在大肠杆菌中很好的分泌表达,这将为纳豆激酶基因工程的深入研究奠定基础。     

麦芽寡糖基海藻糖合酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

应用PCR方法,从芝田硫化叶菌B12中扩增了麦芽寡糖基海藻糖合酶基因（TreY）,扩增产物大小为2．2kb,将扩增片段与pUCm-T连接,得到重组质粒pUCm-T-TreY,CaCl2法转化DH5α,并筛选阳性克隆。用BamHI／Ndel分别双酶切pUCm-T-TreY和表达载体pET21a,连接后得重组pET21a-TreY,转化大肠杆菌DE3并进行了表达。表达产物经SDS-PAGE分析,得到一条分子量约为74kDa的特异条带,同核苷酸序列所推导的值相符。     

人Rab蛋白cDNA的克隆和表达

从人胎脑cDNA文库中克隆到一种新的Rab cDNA,全长920bp,以编码213个氨基酸残基,该蛋白预测的分子质量为24567u,等电点7．34,经同源比较,该cDNA与GenBank数据库中登录号为X14964的Rab蛋白有83％的相似性和76％的相同性,将该cDNA克隆到经改造的PBV220表达质粒,转化DH5a菌株诱导表达出该蛋白,取24种不同组织的总cDNA各100ng,用该基因序列设计引物作PCR,结果在胎肝组织中检测到有明显条带,表明该Rab基因相对在胎肝有高表达。     

B淋巴细胞刺激因子基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

聚合酶链式反应(PCR)扩增获得了编码BLys(134—285AA)的cDNA片段,该片段以限制性内切酶BglⅡ和HindⅢ双酶切插入pET32a载体。测序表明除(ATA^263→ATG^263)突变并导致了氨基酸(1263M)突变外,其余序列与Genbank报道的序列一致。蛋白表达用异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,SDS—PAGE表明：在33ku处有明显的融合蛋白表达,其表达水平高达总茵体蛋白的50％。点印迹证实融合蛋白能与anti—His6Tag抗体反应。生物学活性研究表明BLys协同丝裂霉素能明显地抑制HeLa细胞的生长。     

人Endostatin cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达

Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ是一种新发现的血管生成抑制因子,具有很强的抗肿瘤活性,为了研究人Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ的生物学功能和作用机制,作者从人胎肝组织中克隆到人ＥｎｄｏｓｔａｔｉｎｃＤＮＡ,然后将其插入到ｐＳＱＥ表达质粒中,转化Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ,ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）,获得了ｐＳＱＥ－ＥＮＤ／ＢＬ２１（ＤＥ３）表达工程菌,对其诱导表达产物ｈＥｎｄｏｓｔａｔｉｎ进行了分离、纯化和复性的研究,结     

血管内皮抑素的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

血管内皮抑素不仅能特异性地抑制血管内皮生长，而且对血管形成和肿瘤生长也具有强烈的抑制作用。利用PCR法从人胎肝cDNA文库中克隆了人血管内皮抑素的编码序列，构建了重组质粒pRSendo，并在E.coli中表达，SDS－PAGE表明其表达产物为包涵体，此外，还对血管内皮抑素做了初步的纯化。     

蚯蚓纤溶酶在大肠杆菌中的克隆与表达

根据蚯蚓纤溶酶最佳组分的N-末端氨基酸序列设计简并引物,以蚯蚓cDNA为模板,获得该组分蛋白质的部分编码序列(AF432224,GenBank 登陆号).BLAST相似性分析表明,该序列与U25643和U25648的部分序列相似性达91%, 根据5' 和3' 末端保守序列设计引物,经PCR获得全长cDNA编码序列.将该序列插入pTBY-11质粒,转化大肠杆菌,表达蛋白以包含体形式存在.     

人类抗砷相关基因hARRG全长cDNA的克隆和在E.coli中表达

通过对构建的人胎脑cDNA文库进行大规模测序,发现一条人类新基因,序列与仓鼠asr2序列高度同源,达88％,命名为人类抗砷相关基因（human arsenic resistance related gene.hARRG),hARRG与抗砷基因相关序列ARS2（AF082871）几乎完全全同源,仅比它短253bp,hARRG并不是全长基因而仅是一个cDNA片段,为了获得hARRG全长cDNA,运用Northern blot电子RACE和5－SMART－RACE的方法克隆了一条2999bp 的hARRG全长cDNA,通过Unigene染色体定位于7q21.3,经过生物信息学分析发现,该cDNA有完整的读码框,编码一个788个氨基酸的蛋白,预计分子质量为89．2ku,并在大肠杆菌中获得了成功表达。     

人野生型p53基因的克隆及原核表达

利用RT PCR方法由人外周静脉血淋巴细胞中获得人p53 cDNA片段, 并将其克隆入原核表达载体pQE40中, 构建重组质粒pQE40-p53; 转化于E.coli M15宿主菌, 经IPTG诱导, 表达了N端融合6His的p53融合蛋白. 利用6His与Ni²⁺高亲合力结合的性质, 经镍柱纯化、 透析袋分级透析复性、 Western Blot鉴定, 结果表明获得了纯化的6His-p53融合蛋白.
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大肠杆菌caiE基因的克隆与高效表达

用聚合酶链反应（PCR）从大肠杆菌K12s中扩增大肠杆菌肉碱代谢相关酶基因cai E,将其克隆到克隆载体pBluescripy SK中，测序表明：该基因有612bp，与文献报道相比，有10个核苷酸不同，相应的翻译氨基酸有6个相异，将该基因重组到ColE1为复制子，T7为启动子控制下的分泌型表达载体pET-22b( )中，构建表达质粒pETCaiE，重组到载体pACYC184中构建以p15A为复制子，Lac为启动子的表达质粒pACYC-CaiE；重组到载体pWSK129中，构建以pSC101为复制子，T7为启动子的表达质粒pSC-CaiE。上述表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），经1mmol/L异丙基硫代－β－D－半乳糖苷（IPTG）诱导后，均可表达，SDS－PAGE分析表明表达蛋白分子质量约26ku，表达量占菌体总蛋白质的比例分别为pETCaiE30%,pACYC-CaiE8%,pSC-CaiE5%。     

中国白兔IL-6基因的分子克隆及其表达研究

运用RT-PCR技术对用ConA刺激的中国白兔外周血淋巴细胞(PMBCr)进行了扩增,将纯化后的PCR产物克隆入pMD18-T中进行核苷酸序列测定.结果中国白兔IL-6基因全长726 bp,编码242个氨基酸,其中前26个氨基酸残基构成信号肽序列.与不同物种IL-6基因相比,核苷酸和推导的氨基酸序列有一定的差异.在推导的中国白兔IL-6氨基酸序列中,在108-110位存在1个潜在的N-联糖基化位点,同时存在9个Cys残基.将pTIL-6双酶切,回收目的基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中构建了重组质粒pETIL-6,转化大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG进行了诱导.结果重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为29.5kDa的重组目的蛋白.经凝胶薄层扫描,目的蛋白表达量可占菌体蛋白的16.2%.     

红斑丹毒丝菌C43065株spaA基因的克隆和表达

通过PCR从红斑丹毒丝菌C43065株基因组DNA中扩增出编码信号肽除外的成熟SpaA蛋白基因spaA,将其克隆到表达载体pET32a的BamHⅠ和Hind Ⅲ位点上,构建重组表达质粒pET-spaA,转化大肠杆菌BL21,在IPTG诱导下表达N端带有Trx标签的融合蛋白rSpaA,SDS-PAGE检测表达蛋白.DNA测序结果表明,spaA基因大小为1794 bp,编码由597个氨基酸残基组成的成熟SpaA蛋白,SDS-PAGE结果显示在大肠杆菌BL21中成功表达了分子量约为86 kDa的重组rSpaA,为进一步开展SpaA保护区域的研究奠定基础.