重组包涵体蛋白质复性

基因工程技术的发展掀开了人类生命科学研究的崭新篇章，开辟了现代生物工业发展的新纪元。重组DNA技术为大规模生产目标蛋白质提供了可能，E．coli以其易于操作、遗传背景清楚、发酵成本低和蛋白表达水平高等优点，是生产重组蛋白的首选表达系统。但外源基因在E．coli中的高表达常常导致包涵体的形成，如何高效地复性包涵体蛋白是基因工程技术面临的一个难题。随着人类基因组计划的完成和蛋白组计划的实施，人们将会更多地面临这一问题的挑战。     

丙二酸盐克罗诺杆菌PspA包涵体蛋白的表达、复性及纯化方法优化

为研究丙二酸盐克罗诺杆菌(Cronobacter malonaticus)中噬菌体休克蛋白A(phage shock protein A,PspA)的结构与功能，文章构建了PspA融合蛋白表达载体，但重组蛋白以包涵体形式大量表达；为获取较高浓度的可溶性蛋白进行后续探究，使用尿素裂解液使蛋白变性后，经多种方法复性GST-PspA包涵体蛋白，使其重新恢复生物学活性。研究结果表明，4℃低温条件下包涵体蛋白经尿素梯度稀释透析以控制复性速率，防止蛋白分子快速聚集，可以实现高效复性和纯化GST-PspA融合蛋白。为进一步探索Psp系统中各蛋白的功能及相互作用的研究提供一定的参考。     

以Triton X-100处理重组E.coli制备重组人SOD包涵体

为替代机械破菌法破碎重组E.coli释放重组人超氧化物歧化酶rhSOD (recombinant human SOD)包涵体蛋白,采用非离子表面活性剂Triton X-100处理重组E.coli释放并提取重组人超氧化物歧化酶包涵体.以SDS-PAGE检测破菌效果,采用透析法体外复性包涵体.结果表明:经体积分数0.5％的Triton X-100处理重组E.coli制备的包涵体纯度可达65％,复性48 h,目的蛋白比活达2 801 U/mg,纯度达90％以上.与机械破菌法相比,简单实用,成本低廉,易于放大,无需特殊破菌设备,为规模化生产提供参考.     

L-精氨酸对提高蛋白质复性与纯化率的作用及其分析

分别以还原变性的溶菌酶(Lys)和大肠杆菌(Escherichia coli)中表达的重组人酪氨酸激酶配体(Recombined human Flt3ligand,rhFL)为不同来源的变性蛋白,利用荧光光谱技术分析L-精氨酸(L-arginine,L-Arg)作为小分子添加剂时,蛋白质折叠液相色谱(PFLC)法对变性蛋白质的复性效果,以及变性蛋白复性过程中的复性效率、荧光强度与蛋白构象变化的规律与关系,为解决包涵体蛋白质难于复性和复性效率低的问题提供可靠的数据.     

Long R^3-IGF-Ⅰ的克隆表达

在重组质粒pExSecI-IGF-Ⅰ的基础上,采用基因克隆方法合成了长链人胰岛素样生长因子(Long R3-IGF-Ⅰ)基因序列,构建基于该基因的重组原核表达质粒.将重组质粒转入E.coli,并对其表达条件进行了优化.实验结果表明,在37 ℃,IPTG终浓度0.6 mmol/L,诱导3 h条件下,Long R3-IGF-Ⅰ以包涵体形式可得到高效表达.将包涵体变性溶解后通过分离纯化,目的蛋白纯度达到95%以上.通过尿素梯度透析复性法对变性包涵体复性,复性率达到66%.     

重组人膜联蛋白的尿激酶原融合蛋白衍生物的复性及制备

构建重组人膜联蛋白的尿激酶原融合蛋白基因，并在大肠杆菌中实现高效表达．目标基因表达产物以包涵体形式存在于细菌细胞质中．通过稀释复性的实验方法，对目标基因表达产物进行了变复性处理及进一步的分离纯化，最终制备出具有正确空间结构的有活性的尿激酶原融合蛋白衍生物．     

麻疯树逆境蛋白(curcin 2)基因的原核表达

将编码麻疯树逆境蛋白curcin 2成熟蛋白的M片段和编码前体蛋白的P片段分别定向克隆到质粒载体pQE-30、pQE-31后,获得重组质粒pQE-30-M、pQE-31-P.该重组质粒转化大肠杆菌M15菌株,经IPTG诱导后M片段表达的蛋白质主要以包涵体形式存在,蛋白质的表达量与IPTG浓度及诱导时间有关.重组蛋白可与RGS-His抗体及curcin抗体分别发生专一性抗原抗体反应并被His TrapTMHP柱亲和纯化.体外抗真菌活性实验表明,复性处理后的curcin 2融合蛋白使玉米弯胞杆菌[Curvul     

XynⅢ包涵体的纯化与变复性研究

常规诱导表达后收集的粗包涵体经3mol／L尿素洗涤加上表面活性剂Triton X-100作用，可将包涵体中xynⅢ的含量从37％提高到92．4％；8mol／L尿素可将包涵体完全溶解；蛋白浓度在0．2～0．25mg／mL时，pH4．550mmol／L NaOAc与pH7．520mmol／L Tris—HCl缓冲液复性效果相当；降低蛋白浓度，则是pH7．520mmol／L Tirs-HCl缓冲液复性效果相对较好；复性过程中加入DTT、EDTA、尿素、木糖等处理复性效果没有明显提高；pH7．520mmol／L Tris—HCl、0．01mg／mL蛋白浓度条件下，包涵体的复性效果最佳．     

蛋白质折叠理论与包涵体的处理

多肽链折叠成天然构象的蛋白质决定于蛋白质的一级结构,另外还需要分子伴侣等蛋白质的协助以及ATP提供能量。大肠杆菌等表达体系表达外源基因时,其表达产物量形成包涵体,利用蛋白质折叠理论,可以分析其产生的原因以及建立恰当的蛋白质复性体系。     

重组人肌肌酸激酶包涵体复性条件的探究

采用稀释法研究了重组人肌肌酸激酶(HCK)包涵体的复性条件:蛋白质量浓度、变性剂浓度、复性时间、温度、氧化还原条件等,得到了较为适宜的复性条件.实验还同时发现非离子型去垢剂Triton X-100能有效地辅助HCK的复性,β-环糊精对HCK的复性没有辅助作用.     

噬夏孢欧文氏菌类crtB基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

噬夏孢欧文氏菌类胡萝卜素合成相关基因crtB,编码八氢番茄红素合成酶。利用PCR技术扩增出crtB基因,克隆进表达载体,构建表达质粒pET-15bcrtB。重组质粒转化大肠杆菌,构建工程菌株。经IPTG诱导,工程菌高效表达了重组八氢番茄红素合成酶,表达量占菌体总蛋白的40%。重组蛋白以包含体形式存在,包含体经洗涤、尿素溶解、复性并经镍离子树脂亲和层析、Superdex 75凝胶层析柱纯化,得到了电泳纯的重组八氢番茄红素合成酶,带有His-tag的该蛋白分子量为35 kDa,pI值为7.3。     

GST融合蛋白包涵体纯化方法的探索

克隆结核分枝杆菌培养滤液蛋白CFP10基因,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出CFP10基因片段,克隆至pMD18-T载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到表达载体pGEX-4T-1并在大肠杆菌BL21中表达,表达蛋白经SDS-PAG及Western-blot分析后,亲和层析法纯化蛋白。成功克隆了CFP10基因,并对其在E.coli中进行了表达,SDS-PAGE及Western blot分析表明表达产物正确。通过GST纯化系统获得36kD纯化蛋白,与文献报道相符,该蛋白可与CFP10 mAb特异结合,并且同时与活动期结核病人血清发生反应。成功获得了纯化的CFP10蛋白,为进一步研究CFP10蛋白的致病机理提供了实验依据。     

Expression, refolding and preliminary characterization of recombinant snake venom metalloproteinases: Implica- tion for the hemorrhagic mechanism

Local hemorrhage are common consequences of viperid and crotalid envenoming. Many experiments clearly demonstrated that local hemorrhage can be attributed to snake venom metalloproteinases (SVMPs), which comprise a series of zinc-dependent proteases of varying molecular masses[1,2]. More than 100 SVMPs, including the isozymes from the same species, have been isolated and the amino acid sequences of about 20 enzymes have been determined. They all contain a zinc-binding motif of HEXXHXXGX…     

Expression，reflolding and preliminary characterization of recombinant snake venom metalloproteinases：Implication for the hemorrhagic mechanism

Two cDNAs encoding hemorrhagic snake venom metalloproteinase acutolysin A and non-hemorrhagic metalloproteinase(BR)were cloned into the expression vector pET-22b,respectively,and the corresponding two recombinant proteins,A-22b and BR-22b,were produced in inclusion bodies in E.coli BL21(DE3).The reombinant proteins were then subjected to solubilization,purification and refolding in vitro.A-22b showed hemorrhagic activity and fibronectin.Natural autolysin A had both hemorrhagic activity and proteolytic activity toward these substrates.BR-22b showed the proteolytic activities toward fibrinogen,but no hemorrhagic activity.In addition,two chimeric genes,C1 and C2,were constructed and cloned into pET-22b,and the corresponding recombinant proteins,C1-22b and C2-22b,were also expressed in inclusion bodies.C1-22b involved N-terminal 110 amino acidos of BR and C-terminal 95 amino acids of acutolysin A,while C2-22b contained N-terminal 108 amino acids of acutolysin A and C-terminal 112 amino acids of BR. The biological activities of A-22b and BR-22b,respectively.Our results suggested that N-terminal major subdomain of a snake venom metalloproteinase might play a key role in hemorrhagic activity and have an appreciable effect on the selectivity for protein substrates.     

蚯蚓抗菌肽40 kD Fetidin基因的原核表达与复性

40 kD的fetidin是存在于蚯蚓体腔液中的一种具有较好抗菌活性的蛋白.为了获得大量fetidin,从蚯蚓(Eisenia fetida)中调取fetidin的基因,分别克隆到pKW32和pMXB10中,构建了融合和非融合表达载体,并转化大肠杆菌进行诱导表达.结果无论是融合还是非融合表达,产物均以包含体形式存在.融合表达产物通过亲和层析获得复性,复性产物对粘质沙雷氏菌具有抗菌活性.     

东亚钳蝎抗神经兴奋肽在大肠杆菌中的表达

自从 1 96 4年以来Ｍｉｒａｎｄａ等人[1] 报道Ａｎｄｒｏｔｏｎｕｓａｕｓｔｒａｌｉｓ和Ｂｕｔｈｕｓｏｃｃｉｔａｎｕ中的神经毒素 ,蝎毒中一些神经毒素尤其是哺乳动物毒素和昆虫毒素已被广泛研究 .从新鲜蝎毒中制备和纯化天然神经毒素困难重重 ,1 988年Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ等人[2 ] 首次由Ｂｕｔｈｕｓｅｕｐｅｕｓ蝎中昆虫神经毒素氨基酸序列推导并化学合成其基因序列 ,且在杆状病毒载体中得到表达 ,自此人们广泛试验将各种属的系列蝎毒素基因重组到大肠杆菌、酵母、杆状病毒、植物等表达载体进行表达 .在中国 ,蝎子及其组织或抽提物被…     

斜带石斑鱼神经坏死病毒主衣壳蛋白的原核表达与纯化

将含有斜带石斑鱼Epinephelus coioides神经坏死病毒(orange-spotted grouper nervous necrosis virus,OGNNV)主衣壳蛋白(major capsid protein, MCP)基因的重组表达质粒载体pET32a-MCP转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行融合表达,经SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定,证实了重组大肠杆菌融合表达了斜带石斑鱼神经坏死病毒主衣壳蛋白.表达的融合蛋白主要以不可溶的包涵体形式存在,提取的包涵体中融合蛋白含量占60%以上,经柱层析纯化蛋白,纯化度达90%以上.     

血管抑素3A工程蛋白的柱复性与离子交换纯化

由大肠杆菌以包涵体形式表达的一种抗内皮细胞生长工程蛋白(A nti-ang iogen ic agent,简称3A)经变性,Sephacry l S-100 HR柱复性,SP Sepharose FF离子交换吸附纯化,SephadexG-25脱盐,获得复性率为53.47%,HPLC纯度为92.52%的3A活性蛋白。以猪髋动脉内皮细胞为受检细胞,表明纯化蛋白具有抑制内皮细胞生长的特性。     

重组基质金属蛋白酶MT5-MMP的表达、 纯化和复性

对已经构建成功并转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)的基质金属蛋白酶MT5 MMP的催化结构域进行诱导表达, 得到分子量为21000, 包涵体形式的重组蛋白. 通过离子交换树脂对目的蛋白进行纯化后, 用凝胶过滤树脂对纯化后的蛋白进行柱上复性, 得到了具有较高活性的重组蛋白.     

重组人DNaseⅠ不同表达模式的下游工艺研究

研究了诱导温度对重组人DNaseⅠ(rhDNaseⅠ)在大肠杆菌中可溶表达的影响,发现加诱导剂后在37℃培养时,rhDNaseⅠ融合蛋白以包涵体形式存在;而20℃培养,rhDNaseⅠ融合蛋白有62.3%分泌到周质,并且具有酶活性。对这两种不同表达模式表达的rhDNaseⅠ融合蛋白进行分离纯化,发现前者最终酶活为592.2 U/mg,回收率为32.1%;后者酶活为1283U/mg,回收率为24.1%。比较这两种纯化工艺,分泌表达模式的分离纯化工艺较好。