发酵抑制物对树干毕赤酵母戊糖发酵的影响

研究了常见发酵抑制物(甲酸、醋酸和乙醇)对树干毕赤酵母(Pichia stipitis)P2生长和发酵木糖的影响.结果表明:树干毕赤酵母P2具有良好的抗发酵抑制物能力.当发酵液中含有4.0 g/L的醋酸时,树干毕赤酵母P2生长和发酵木糖情况良好;当发酵液中含有5.0g/L的甲酸时,树干毕赤酵母P2对木糖的利用率降低,但对酵母生长的影响并不明显;另外,树干毕赤酵母P2耐受乙醇的浓度约为40.0 g/L.     

海藻酸锰固定化细胞的乙醇发酵

以树干毕赤酵母(Pichia stipitis)为发酵菌株，利用海藻酸锰凝胶代替海藻酸钙，固定化酵母使用寿命明显增加。采用混合糖60g／L(50％葡萄糖、50％木糖)为发酵底物，以250mL三角瓶为反应器，在35℃、150r/min、pH5．0条件下，振荡发酵。结果表明，海藻酸锰树干毕赤固定化增殖酵母细胞能使戊糖和己糖同步发酵，海藻酸锰凝胶耐磷酸盐能力是海藻酸钙凝胶的3倍，海藻酸锰固定化树干毕赤酵母细胞乙醇发酵42d，固定化细胞稳定，总糖利用率为95．8％，乙醇得率为理论得率的92．3％，发酵稳定时间明显长于海藻酸钙固定化酵母细胞乙醇发酵的稳定时间(24d)。     

戊糖己糖混合糖发酵生产乙醇的主要影响因素

以树干毕赤酵母为发酵菌株,高混合糖(木糖、葡萄糖)为发酵底物,确定树干毕赤酵母高糖浓度发酵时所需的条件.研究结果表明,在高糖浓度乙醇发酵中,树干毕赤酵母较为适宜的发酵温度为30℃,发酵24 h,残糖浓度和乙醇浓度分别为0.1 g/L和32.5 g/L.添加硫酸铵1.1 g/L+微量元素发酵效果较好,乙醇浓度为33.2g/L.由典型发酵过程中各物质浓度变化曲线可知,酵母优先利用葡萄糖,发酵12 h葡萄糖和木糖的还原糖利用率分别为89.3%、10.7%.待12 h葡萄糖几乎被消耗完后,对木糖的利用开始占主导地位,乙醇浓度随着糖的不断消耗而逐渐提高.发酵28h时乙醇浓度最高,达到33.2 g/L.     

木糖发酵菌株的筛选

本实验利用传统的方法从森林土样中分离筛选出一株能有效发酵木糖生产乙醇的酵母菌株。首先通过富集培养、初筛、复筛等步骤筛选出一株（1#菌株）能够利用木糖的酵母菌株,对其进行了生理生化性能指标试验,初步鉴定为假丝酵母菌（Candida sp.）。并对其进行了利用木糖发酵乙醇试验,实验结果表明：在培养温度为30℃,pH5.0,接种量为10％左右,初始木糖浓度为40g/L时,该菌株可以利用木糖发酵生产乙醇,产乙醇量为1.06g/100mL,相当于理论转化率的56.9%。     

高耐受性拜氏梭菌的离子束诱变选育

【目的】为了优化生物丁醇生产工艺,研究拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)对有毒物质的耐受性。【方法】利用常温等离子诱变技术选育获得1株突变株C.beijerinckii GZ-9,并通过摇瓶发酵对比原始菌株C.beijerinckii NCIMB 8052和突变株GZ-9对有毒物质的耐受性。【结果】NCIMB 8052在酚浓度为1.5g/L的发酵液中已不能生长,而GZ-9在酚浓度2.4g/L的发酵培养基中生长良好;当可溶性总酚浓度为1.5g/L时,实验总溶剂产量和丁醇产量分别达9.2g/L和6.5g/L。【结论】突变株GZ-9对未脱毒甘蔗渣酸解糖液中毒素物质的耐受性远高于原始菌株NCIMB 8052。     

木糖产乙醇微生物的育种研究进展

甘蔗渣水解产物中含量第二高的是木糖，利用微生物高效转化木糖产乙醇是目前蔗渣纤维综合利用的关键途径之一，但野生型酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）不能利用木糖发酵产乙醇，这成为当前纤维素乙醇实现产业化生产的主要瓶颈之一。本文从微生物木糖代谢途径、利用木糖产乙醇的微生物、木糖产乙醇基因工程菌的构建、利用传统诱变方法改良木糖乙醇菌种等4个方面综述当前木糖产乙醇微生物的育种研究进展，指出木糖乙醇发酵最为理想的微生物菌种和最有应用前景的微生物分别是树干毕赤酵母（Pichia stipitis）和酿酒酵母基因工程菌，为改良木糖乙醇微生物提供理论依据。     

γ-聚谷氨酸高产菌株的选育和发酵培养基的初步优化

以实验室保藏的一株枯草芽孢杆菌为出发菌株,采用紫外、亚硝基胍以及60Coγ射线对其进行复合诱变,获得一株γ-聚谷氨酸高产突变株,在基础培养基中产量是出发菌株的3.11倍,并且突变株经过传代10次,发酵能力稳定;通过正交试验对突变株的发酵培养基进行了初步优化,突变株在一组培养基上的γ-聚谷氨酸产量可达到33.81g/L,是优化前的1.11倍。该突变株的摇瓶发酵产量较高,值得深入开发研究。     

毕赤酵母新型反向筛选标记基因的鉴定

利用转座子突变技术构建毕赤酵母菌株突变库,并分离出能够在含雷帕霉素（10 ng/mL）培养基中生长的突变株mut375.通过热不对称交错PCR（TAIL-PCR）获取转座子侧翼序列,对转座子的插入位点进行定位.转座子插入PAS_Chr2-2₀375基因,破坏了其开放阅读框的完整性,将该基因命名为kFPR1.本研究利用同源重组敲除kFPR1基因使毕赤酵母产生了雷帕霉素抗性,回补该基因功能的菌株则不能在含雷帕霉素的培养基上生长.基于kFPR1基因的特性,建立了一种适用于毕赤酵母的无标记基因操作方法.以kFPR1作为反向筛选标记成功构建了表达EGFP的重组菌株并且回收了ZeoR筛选标记,为毕赤酵母的遗传操作提供了新的筛选工具.     

嗜热厌氧杆菌乳酸脱氢酶敲除对乙醇发酵的影响

为提高乙醇产率,通过同源重组的方式敲除嗜热厌氧杆菌乳酸支路中的乳酸脱氢酶基因,得到了嗜热厌氧代谢工程菌Δldh突变株.应用葡萄糖、木糖、葡萄糖/木糖混合糖3种碳源,分别对Δldh突变株与野生菌进行分批补料发酵产乙醇的研究.结果表明,与野生菌相比,Δldh突变株不仅显著提高了乙醇产率,而且提高了糖的消耗速率;Δldh突变株与野生菌都能以葡萄糖和木糖为基质生长,而与木糖为单一碳源相比,在葡萄糖/木糖共发酵时,木糖消耗速率有所降低;在以葡萄糖为单一碳源时,Δldh突变株的乙醇质量浓度和产率达到最高,分别为25.93 g/L和0.39 g/(L.h).     

原位预处理甘蔗糖蜜对耐高温酿酒酵母突变株Saccharomyces cerevisiae AQ生产乙醇的影响

【目的】探讨和分析原位预处理糖蜜促进酿酒酵母生长和乙醇生产的原因,开发一条绿色、低成本糖蜜乙醇生产途径。【方法】先在不同温度和初始糖浓度条件下,考察酿酒酵母原始菌株Saccharomyces cerevisiae A及其突变株Saccharomyces cerevisiae AQ的生长和乙醇生产性能差异,再以原位预处理前后糖蜜为发酵底物,测定突变株Saccharomyces cerevisiae AQ在不同培养基中的生长量、出芽率、乙醇产量、胞内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶、细胞质内ATP酶和线粒体内ATP酶活力,研究原位预处理糖蜜对其生理特性的影响。【结果】在高温发酵糖蜜过程中,突变株Saccharomyces cerevisiae AQ较原始菌株Saccharomyces cerevisiae A表现出更好的生长和乙醇发酵稳定性。当以原位预处理糖蜜作为Saccharomyces cerevisiae AQ唯一碳源时,其胞内SOD酶、过氧化物酶、细胞质内ATP酶和线粒体内ATP酶活力较以糖蜜原料为唯一碳源时分别提高2.51倍,0.92倍,1.80倍和1.45倍,乙醇收率为31.07%,较以糖蜜原料为唯一碳源时提高36.26%。【结论】突变株Saccharomyces cerevisiae AQ较原始菌株Saccharomyces cerevisiae A更适用于糖蜜发酵生产乙醇体系,且新型的原位预处理方法能通过增强Saccharomyces cerevisiae AQ在糖蜜培养基中的呼吸作用,提高菌株活力,从而进一步提高乙醇收率。     

Fermentation of xylose to produce ethanol by recombinant <Emphasis Type="Italic">Saccharomyces cerevisiae</Emphasis> strain containing <Emphasis Type="Italic">XYLA</Emphasis> and <Emphasis Type="Italic">XKS1</Emphasis>

Fermentation of the pentose sugar xylose to produce ethanol using lignocellulosic biomass would make bioethanol production economically more competitive. Saccharomyce cerevisise, an efficient ethanol producer, cannot utilize xylose because it lacks the ability to convert xylose to its isomer xylulose. In this study, XYLA gene encoding xylose isomerase (XI) from Thermoanaerobacter tengcongensis MB4T and XKS1 gene encoding xylulokinase (XK) from Pichia stipitis were cloned and functionally coexpressed in Saccharomyces cerevisiae EF-326 to construct a recombinant xylose-utilizing strain. The resulting strain S. cerevisiae EF 1014 not only grew on xylose as sole carbon source, but also produced ethanol under anaerobic conditions. Fermentations performed with different xylose concentrations at different temperatures demonstrated that the highest ethanol productivity was 0.11 g/g xylose when xylose concentration was provided at 50 g/L. Under this condition, 28.4% of xylose was consumed and 1.54 g/L xylitol was formed. An increasing fermentation temperature from 30℃ to 37℃ did not improve ethanol yield.     

酿酒酵母呼吸突变株的高糖胁迫反应研究

【目的】研究野生型甘蔗糖蜜发酵高产乙醇菌株MF1002及其糖分利用能力显著提高的呼吸突变菌株MF15c在高糖胁迫下的生理特性变化。【方法】测定在高糖胁迫下菌株的生长速率、出芽率、乙醇产量和超氧化物歧化酶(SOD)活力、过氧化氢酶活力、过氧化物酶活力以及细胞质和线粒体的ATP酶活力。【结果】在葡萄糖浓度分别为25%、30%和40%的高糖培养基中,MF15c菌株生长和乙醇发酵受抑制的程度均明显低于MF1002。当葡萄糖浓度为30%和40%时,MF15c的最大菌体数目、最高出芽率和乙醇发酵浓度等均显著高于MF1002。当葡萄糖浓度为30%时,两菌株胞内的SOD活力、过氧化氢酶活力、过氧化物酶活力以及细胞质和线粒体的ATP酶活力均显著上升。其中,MF15c的胞内SOD活力、胞内过氧化物酶活力、细胞质ATP酶活力和线粒体ATP酶活力在高糖胁迫下的上升幅度显著高于MF1002。【结论】MF15c较MF1002具有更强的高糖耐受能力。SOD活力、过氧化氢酶活力、过氧化物酶活力以及细胞质和线粒体的ATP酶均参与了两菌株的高糖胁迫反应,胞内SOD活力、胞内过氧化物酶活力、细胞质ATP酶活力和线粒体ATP酶活力可能与MF15c菌株的高糖耐受能力有关,可作为进一步改造该菌株的指导指标。     

斑点鳟的外形特征与消化系统结构

【目的】研究斑点鳟Oncorhynchus mykiss外部形态特征与内部消化系统结构。【方法】观察并描述斑点鳟外部形态特征,测量30尾斑点鳟的外部形态参数,对其进行相关性分析;解剖观察斑点鳟的消化系统结构特征。【结果】斑点鳟外部形态参数全长(LT)与体长(LB)的相关关系为LT=1.21 LB-3.25(R2=0.948),体质量(W)与全长(LT)的关系为W=0.001 LT3.562(R2=0.754),其余几项形态参数之间相关性较低;可数性状背鳍、臀鳍、腹鳍、胸鳍、尾鳍的鳍条数分别为6~12、9~15、10~24、20~28、23~33;具有1条侧线;第1鳃弓鳃耙数为15~18。斑点鳟为典型的肉食性鱼类,其消化系统结构特征为口咽腔较小,颌齿发达;食道短粗;胃发达,呈V形,分化明显;肠在腹腔内呈两个盘曲,肠长/体长为0.503±0.09;幽门盲囊数为48~72个。【结论】该实验结果可为斑点鳟的消化生理研究以及养殖管理提供科学的理论依据。     

酿酒酵母高产菌株的木薯酒精产业化生产试验

【目的】对酿酒酵母高产菌株Ygxas-49木薯酒精产业化应用进行试验。【方法】先在200t发酵罐进行分批发酵,对该菌株的各个发酵指标进行评估,再将可行的方案进一步放大至年产12万t酒精生产线上进行生产稳定性试验,最后为考察该菌在产业化应用上的潜力,在200t发酵罐进行高浓度酒精发酵试验。【结果】200t发酵罐分批发酵结果表明:与生产对照菌株相比,酒度提高8.92%,发酵时间减少12h以上,其他发酵指标基本相同。采用该菌株生产酒精可以提高酒度,大大节约发酵时间,增加设备利用率,从而降低酒精生产成本。12万t酒精生产线稳定运行30d结果表明:与生产对照菌株相比,酒度提高5.35%,发酵时间减少10h以上,其他发酵指标基本相同。200t发酵罐高浓度酒精发酵结果:酒度为15.1%(V/V),发酵时间为56h,与目前文献报道最高生产水平(酒度13.5%,V/V;发酵时间69h)相比,酒度提高11.85%,发酵时间缩短13h。【结论】Ygxas-49菌株应用于工业化生产,各项工艺指标均显著优于国内目前最高水平,具有良好的工业化应用前景。     

海绵Pseudoceratina sp.共栖细菌多样性及其抑制甘蔗鞭黑粉菌活性研究

【目的】探讨广西斜阳岛附近海域海绵共附生细菌的多样性,并筛选对甘蔗鞭黑粉菌有抑制作用的活性物质,为发现潜在的细菌新物种及开发农用生防菌肥奠定基础。【方法】采用稀释涂布法,通过6种复合营养分离培养基,从海绵Pseudoceratina sp.中分离可培养的共附生细菌。采取细菌形态学观察去除冗余,通过PCR扩增菌株的16SrRNA基因序列,并通过构建系统发育树分析物种多样性。采用牛津杯法进行抑制甘蔗鞭黑粉菌活性筛选实验。【结果】从海绵Pseudoceratina sp.中共分离到可培养细菌54株,经16SrRNA基因序列对比后,获得24株细菌,隶属于13科14属。其中,菌株BGMRC 2118与已发表有效菌株的16SrRNA基因序列的最高相似率为96.46%,可能为潜在新种。抑菌筛选实验结果显示,有8株细菌的发酵粗提物对甘蔗鞭黑粉菌具有很强的抑菌活性。【结论】广西斜阳岛附近海域中海绵共附生细菌具有较高的物种多样性,蕴藏着丰富的新物种资源,富含生物活性菌株。     

酿酒酵母YBR019C基因缺失突变的分析

【目的】研究目的基因YBR019C缺失对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株糖代谢和乙醇发酵的影响。【方法】以酿酒酵母野生菌NF1002为出发菌株,选择2号染色体上的基因YBR019C为目的基因,以质粒pUG6和pUG66为模板进行PCR,构建带有Cre/loxP系统的酿酒酵母YBR019C基因敲除组件,并转化酿酒酵母NF1002,利用筛选标记Kan r和Ble r与YBR019C基因进行同源重组,筛选YBR019C双倍体缺陷型菌株。利用蔗糖和甘蔗糖蜜为碳源,对突变菌进行发酵特性的研究。【结果】成功获得YBR019C双倍体缺陷型菌株NFybr。碳源同化实验表明,突变株和野生菌均能利用葡萄糖和蔗糖,不能利用乳糖和木糖;但相比野生菌,突变株利用棉子糖和麦芽糖的能力有所下降,而且完全不能利用半乳糖。蔗糖发酵实验表明:突变株NF-ybr与野生菌株相比,在发酵终点乙醇浓度提高10.7%,发酵周期有所延长。按目前甘蔗糖蜜乙醇生产的发酵工艺,突变株在30℃发酵72h的醪液乙醇含量为12.52%,低于野生菌的13.89%。【结论】YBR019C基因的缺失影响了菌株对糖份的利用,导致乙醇发酵能力不及野生菌。本研究为菌株高效快捷的基因改造提供了参考。     

鼠尾藻群体的有性生殖力影响因素研究

【目的】研究鼠尾藻(Sargassum thun bergii)有性生殖相关因子间的关系,分析鼠尾藻群体的有性生殖能力。【方法】通过统计分析方法,研究藻体长度与侧枝数、侧枝长度与生殖托数、生殖托长度与生殖托挂卵数间的关系。【结果】藻体长度与侧枝数、侧枝长度与生殖托数、生殖托长度与生殖托挂卵数间都为线性正相关,利用回归方程推算,1株成熟的鼠尾藻藻体能产生2×105~3.3×106个受精卵。【结论】1株成熟鼠尾藻的产卵量基本可满足1m2的采苗生产需要。