DNA甲基化检测研究新进展

哺乳动物DNA的甲基化几乎皆发生在CpG二核苷酸的胞嘧啶上, 在基因调控区启动子上富含CpG序列, 而这些CpG序列的甲基化水平与基因的调控和肿瘤的发生和发展有着极其重要的关系. 近年来, 随着聚合酶链式反应技术(PCR)的快速发展, 抑癌基因的高甲基化与癌症的关系得到不断深入的研究. 与抑癌基因启动子区CpG岛的异常甲基化相关的抑癌基因失活, 是癌症发生的一个重要机制. 一些基因的过甲基化有可能成为肿瘤乃至癌细胞形成的标志物. 在癌症早期了解相关抑癌基因启动子区CpG岛的甲基化状态, 对于及时发现和治疗癌症具有重要意义.     

拟南芥profilin2启动子5′端缺失对维管束特异表达的影响

用PCR法扩增并克隆了profilin2全长启动子（1667bp），经5′端不同长度缺失，与gus（uidA）基因连接，构建植物表达载体，转化伽蓝菜，证实在转基因植株中全长启动子Pfn1．7，呈维管束特异表达，5′端缺失分析显示，可将该启动子分为3个区段：区段1，－1167－1380bp，缺失该区段为gus基因由维管束特异表达变为组成型表达，推测在该区段中存在维管束特异表达元件；区段2，－1153－－597bp，强烈抑制gus基因的表达；区段3,-597－－1bp，可认为是profilin2的基本启动子。     

抑制COM与CCoAOMT调控植物木质素的生物合成

咖啡酸－3－O－甲基转移酶（COMT）与咖啡酰辅酶A－3－O－甲基转移酶（CCoAOMT）基因分别编码植物木质素生物合成中不同底物水平的甲基化酶，构建了它们的单价与双价反义表达载体，并用农杆菌介导转化烟草。PCR－Southern检测表明外源基因已整合到烟草基因组DNA中；Northern点杂交结果表明外源基因在烟草中以转录水平表达。对表达单个及两个甲基化反义基因的成熟转基因植株的木质素含量测定结果表明，反义抑制COMT与CCoAOMT的表达均使转基因植株的木质素含量下降，但单独抑制CCoAOMT表达引起的下降幅度明显大于COMT，并且两个基因同时被抑制时，降低幅度更大，说明它们具有协同效应，组织化学染色结果表明COMT被抑制引起紫丁香基（S）木质素显著减少。上述结果表明，抑制植物内源CCoAOMT表达是反向调控转基因植物木质素生物合成及改良造纸资源植物的有效途径。     

抑制衰老的嵌合基因在水稻中的转化

利用基因枪法把带有特异衰老基因ＳＡＧ１２启动子的ＩＰＴ基因导入水稻,经ＰＣＲ,点杂交以及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析,证明外源基因已整合到水稻基因组中,通过ＧＵＳ活性细胞分裂素含量的分析以及Ｔ１代转基因植株成熟期的形态观察,证明此抑制衰老的自我调节系统在部分转基因水稻中表达,叶片衰老受到明显的抑制。     

表达雪花莲凝集素(GNA)的转基因水稻纯系抗褐飞虱

利用基因枪法将含有潮霉素抗性基因pht,gusA报告基因和雪花莲外源凝集素基因gna的2个质粒（pWRG1515和pRSSGNA1)共转化粳稻品种鄂宜105号和鄂晚5号种子胚诱导的愈伤组织。从轰击的329块愈伤中共再生出61株独立转基因植株。PCR／Southern blot分析显示,79％的转基因植株含有所有3个外源基因。Western blot分析发现,48株含gna基因的转基因植株中有36株（75％）在不同水平上表达了GNA,GNA最高表达量占总可溶性蛋白的0．5％,遗传分析证实外源基因在转基因后代植株中大多以孟德尔方式遗传。从其R1代为3：1孟德尔分离方式遗传的后代R2代植株中,鉴定出含有并表达所有3个外源基因的5个独立转基因植株纯系。褐飞虱生物鉴定和喂养试验表明,转基因纯系对褐飞虱具有显著的抑制作用,具体表现为降低褐飞虱存活率和繁殖力、延缓褐飞虱发育进度及减少褐飞虱进食量,即表达GNA的转基因水稻纯系对褐飞虱具有抗性作用。     

通过叶绿体基因工程表达聚3-羟基丁酸酯合成相关基因

构建了含phbB, phbA, phbC和aadA基因表达盒的叶绿体整合及表达载体, 通过基因枪轰击法转化烟草. 对具壮观霉素抗性的植株进行PCR和Southern等分析, 确证外源基因已整合到叶绿体基因组中, 同时测定了其同质化程度. Northern点杂交、RT-PCR分析结果表明, 叶绿体型转基因植株中目的基因在转录水平的表达明显高于核转化植株中相应基因, 并且未观察到基因沉默现象. 叶绿体型转基因植株还具有环境安全性好、底物丰富、产物区域化等优点, 表明叶绿体基因工程在转基因植物生产聚3-羟基丁酸酯(PHB)方面极具潜力.     

用PEG法向小麦原生质体导入外源基因获得转基因植株

目前用基因工程方法改良小麦是世界上普遍关注的课题,但其有效外源基因转化系统的建立却十分困难.Vasil 等曾用基因枪法转化小麦悬浮细胞获得转化的愈伤组织;最近他们又用相同的方法转化小麦胚性愈伤组织得到了抗除草剂的小麦转基因植株.我们在小麦原生质体再生植株获得成功的基础上,通过反复实验,用 PEG 处理法将外源基因导入小麦原生质体,通过培养和对转化细胞的筛选,获得了完整的转基因小麦再生植株.     

通过叶绿体基因工程表达聚3-羟基丁酸酯

构建了含phbB,phbA,phbC和ααdA基因表达盒的叶绿体整合及表达载体，通过基因枪轰击法转化烟草，对具壮观霉素抗性的植株进行PCR和Southern等分析，确证外源基因已整合到叶绿体基因组中，同时测定了其同质化程度。Northern点杂交、RT－PCR分析结果表明，叶绿体型转基因植株中目的基因在转录水平的表达明显高于核转化植株中相应基因，并且未观察到基因沉默现象，叶绿体型转基因植株还具有环境安全性好、底物丰富、产物区域化等优点，表明叶绿体基因工程在转基因植物生产聚－3－羟基本丁酸酯(PHB）方面极具潜力。     

抗小麦黄花叶病毒转基因小麦的获得及病毒诱导的基因沉默

利用Act1启动子和除草剂选择标记bar基因，构建了含有小麦黄花叶病毒外壳蛋白基因的植物表达载体，采用基因枪法导和小麦品系，经PCR和PCR－RFLP对转基因小麦T0代及T1代进行检测后，对阳性植株的后代株系（T2代）进行田间抗病性检测。结果表明，外源基因可以在后代中遗传，并且其中一个转基因株系的后代(P8-T2)对小麦黄花叶病毒呈现高度抗性，经Westernblot和RT－PCR检测发现，抗病转基因小麦体内外壳蛋白基因在病毒感染后的表达水平出现明显下降，认为所获得转基因小麦的抗性是由病毒诱导的基因沉默引起的。     

福兮?祸兮?转基因植物

近来,常常听到欧洲某国的人们拒绝接受转基因产品,并为此向政府提出抗议,要求禁止这类产品生产的消息。转基因到底是什么?它为什么会让人如此情绪激昂呢?下面就和大家谈一谈植物转基因技术。 植物体内的“异己分子” 转基因技术就是将外源基因(不是受体细胞本身具有的基因)设法导入受体细胞,使受体细胞获得外源基因所表征的特性。那么如何将外源基因转入植物细胞中呢?早先人们发现在土壤中的一种植物病原菌——土壤农杆菌能侵入植物的受伤部位,使植物产生瘤,而瘤的组织基因组中插入了农杆菌的基因。进一步研究发现,这种菌中有Ti质粒,它是一个闭合环状的双链DNA分子,该质粒上的一段DNA,称为T—DNA,它能转移并整合进植物基     

多个抗病抗虫基因在水稻中的遗传和表达

将２￣３个抗真菌病基因与潮霉素磷酸转移酶基因串联在一载体上,两个抗虫基因与ＰＰＴ乙酰转移酶基因串联在另一载体上,利用基因枪法将它们按照１：１的摩尔比共同导入到水稻胚性愈伤组织中。通过潮霉素抗性筛选共得到５５个独立的再生植株系,其中,有７０％的转基因植株含有６￣７个外源基因,且位于同一载体上的几个外源基因总是共同导入到水稻植株中,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析证明多个外源基因均能稳定表达。在分析的含     

抑制COMT与CCoAOMT调控植物木质素的生物合成

咖啡酸-3-O-甲基转移酶（COMT）与咖啡酰辅酶A-3-O-甲基转移酶（CCoAOMT）基因分别编码植物木质素生物合成中不同底物水平的甲基化酶,构建了它们的单价与双价反义表达载体,并用农杆茵介导转化烟草.PCR-Southern检测表明外源基因已整合到烟草基因组DNA中;Northern点杂交结果表明外源基因在烟草中以转录水平表达.对表达单个及两个甲基化酶反义基因的成熟转基因植株的木质素含量测定结果表明,反义抑制COMT与CCoAOMT的表达均使转基因植株的木质素含量下降,但单独抑制CCoAOMT表达引起的下降幅度明显大于COMT,并且两个基因同时被抑制时,降低幅度更大,说明它们具有协同效应.组织化学染色结果说明COMT被抑制引起紫丁香基（S）木质素显著减少.上述结果表明,抑制植物内源CCoAOMT表达是反向调控转基因植物木质素生物合成及改良造纸资源植物的有效途径.     

根特异性表达顺式激活序列在转基因烟草中的功能分析

高等植物基因在各组织中的特异性表达需通过组织特异性启动子的调控。根是植物体的重要器官，其特异性基因的表达和调控对研究植物的生长和发育具有重要意义。通过对烟草根特异性表达基因TobRB7启动子的分析，成功分离了包含顺式激活序列 的不同长度的片段RSF1和RSF2。将RSF1和RSF2以不同方向与含有GUS编码基因的表达型载体进行重组后，以农杆菌介导转化烟草获得相应 的转基因植株。在对转基因烟草的GUS表达特性进行组织化学鉴定和荧光定量分析后发现，TobRB7启动子具有双向启动子功能，并均表现出根组织特异性。结果表明，在－823至＋70bp区域存在正反不同方向的根组织特异性调控元件，该启动子片段在反向插入和较短区域内有较强的根组织特异性表达调控功能。     

JUN和FOS基因增加水稻prolamin 4a基因的表达

水稻prolamin基因的表达具有发育(开花后种子成熟过程中)和组织(胚乳)的特异性,是研究基因表达调控的理想材料。目前,关于水稻prolamin cDNA和13,10kD prolamin的基因已经定序,而对其表达特异性在分子水平上的机理,尚未见报道. 周先锦、范云六报道了prolamin 4a基因启动子的序列并在转基因烟草植株中证实了该启动子的发育和组织特异性表达功能。该启动子属于13kD prolamin基因启动子,具有与     

利用ubi1内含子增强Bt cry1Ah基因在转基因玉米中的表达

Bt cry1Ah基因是从国内苏云金芽胞杆菌分离株BT8中鉴定克隆的新型杀虫蛋白基因. 本研究构建了两个含有Bt cry1Ah基因的植物表达载体, 在其中一个植物表达载体(pUUOAH)的玉米Ubiquitin启动子与cry1Ah基因之间插入了玉米泛素蛋白基因ubiqutin1的第一个内含子(ubi1). 利用基因枪法将其导入玉米(Zea mays L.)胚性愈伤组织中, 得到了可育的再生植株. PCR及Southern blot检测结果表明, cry1Ah基因已整合入玉米基因组中, 并稳定遗传至下一代. 对T₁及T₂代转基因植株进行ELISA检测, 发现pUUOAH载体转基因植株Cry1Ah蛋白的平均表达量提高了20%. 对T₂代转基因植株进行了田间抗虫性鉴定, 发现转cry1Ah基因玉米对玉米螟有很高的抗性, 并且pUUOAH载体转基因植株的抗虫性好于pUOAH(无内含子)载体的转基因植株. 以上结果表明, 玉米ubi1内含子可以有效增强cry1Ah在转基因玉米中的表达.     

利用土壤农杆菌将天花粉蛋白基因转入水稻植株并检测抗稻瘟病活性

通过土壤农杆菌方法将天花粉蛋白基因转化到水稻中,获得了具有单拷贝外源基因插入和表达的水稻再生植株,抗稻瘟病（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ）检测发现,接病菌后１个月内转天花粉蛋白基因植株在发病时间、发病植株数、发病叶片、发病后的植株生长状况等各项指标上与对照的转ＧＵＳ基因植株比较均有较大差异。在去除高温湿度的发病环境后,转天花粉蛋白基因植株的生长情况也明显优于对照植株,表明转基因水稻对稻温病     

基因枪转多基因库安托杨的获得

通过基因枪共转化方法将枯草杆菌果聚糖蔗糖酶基因(SacB)、透明颤菌血红蛋白基因(vgb)、双价抗蛀干害虫基因(BtCry3A+OC-Ⅰ)、调节基因JERF36及报告基因NPTⅡ等外源基因导入库安托杨, 共获得25株抗性植株. PCR及Southern杂交结果表明, 外源基因已整合到库安托杨基因组中, 其中7株含有上述全部5个外源基因. BtCry3A ELISA实验表明, 上述7株库安托杨BtCry3A基因已得到表达. 且上述转基因植株在滨海盐碱地中生长良好.     

分化和适应相关表观遗传与胃癌转化研究进展

表观遗传修饰在人体细胞分化和适应环境上均发挥重要调控作用.一方面,细胞分化相关表观遗传非常稳定,具有明显的组织器官和细胞类型特异性;另一方面,机体对环境的适应性表观遗传则因环境因素不同而异,稳定性较低.这两类不同的表观遗传修饰在医学上具有不同的转化应用范围.恶性转化是机体组织中少数干细胞对环境致癌因素暴露做出的病理性适应反应的结果——细胞通过去分化重编程,获得无限制增殖和运动侵袭能力,同时拥有分化和适应性表观遗传变化特征.DNA甲基化变异的分析方法极其灵敏,可准确检出组织中少数细胞存在的变化,在识别癌前病变组织中的恶性转化细胞和肿瘤组织中的转移干细胞方面有重要应用前景.在前期研究中,我们已经证明肿瘤抑制基因p16甲基化失活可用作胃等器官上皮异型增生癌变的早期标志物.通过对胃癌发生发展相关DNA甲基化组扫描获得的90余个基因的DHPLC大规模验证,发现GFRA1的去甲基化激活、SRF和ZNF382的甲基化失活可用作胃癌等恶性肿瘤的转移标志物,已经在中、日、韩三国验证队列中得到证明;通过人群研究还发现血浆miR-221等含量的进行性升高可能是胃癌发生的预警信号.     

油菜种子萌发过程中DNA甲基化的MSAP分析

DNA甲基化对于植物的生长发育和组织分化具有十分重要的调控作用. 用MSAP (methylation- sensitive amplified polymorphism)和HPLC两种方法分析了油菜种子萌发过程中DNA甲基化的动态变化过程, 并且比较了不同器官组织的甲基化水平差异. MSAP的分析结果表明, 油菜种子基因组中大约有15.7%的CCGG位点发生了胞嘧啶甲基化, 发生甲基化的方式以C^5mCGG双链甲基化为主; 种子萌发过程中同时发生甲基化和去甲基化事件, 其中去甲基化占据主导地位; 不同器官组织的甲基化水平存在一定差异, 胚根的甲基化水平最低, 下胚轴次之, 子叶最高, HPLC分析结果与此一致. 最后, 对11个甲基化多态性片段进行了序列分析, 发现基因编码区和非编码区发生DNA甲基化的频率基本相等. 由此可见, 种子萌发过程中DNA的甲基化变化是一个十分复杂的过程, 油菜可能通过甲基化和去甲基化的方式调控基因的表达, 并最终决定植株的生长发育和器官分化.     

小鼠精子捕获外源DNA的研究

随着遗传工程研究的发展,现今已有多种方法实现外源基因向受体细胞的转移。较常用的方法有显微注射法和反转录病毒载体等方法。但晚近Lavitrano等报道用精子作为外源DNA的载体可以生产转基因动物。这一报道引起了国内外学者的广泛关注。一些作者试图重复这一实验,但至今还没有成功的报道。虽然如此,至今并不能排除精子作为外源DNA的载体的可能性。对这一问题的研究,至少具有以下三方面的意义。第