人甲胎蛋白增强子和鸡HS-4绝缘子对杆状病毒基因表达的影响

构建了2株重组杆状病毒AcGFP-E和AcGFP-E-I.两者均带有绿色荧光蛋白报告基因(gfp)的表达框和人甲胎蛋白增强子,同时后者还在报告基因表达框两侧带有鸡HS-4绝缘子.在昆虫细胞Sf9中,两种重组病毒都能正常复制.与仅带有报告基因的对照重组病毒AcGFP比较,AcGFP-E表达GFP的水平明显提高,但AcGFP-E-I表达水平却明显降低.这项研究首次分析了异源增强子和绝缘子对杆状病毒基因表达的影响,但其中的机制还有待深入研究.     

鸡染色质绝缘子HS4的不同区域对杆状病毒表达egfp基因的影响

染色质绝缘子是一种具有保护目的基因免受周围基因调控影响,保证基因稳定表达的DNA元件.前期的研究表明,当鸡染色质绝缘子HS4被置于目的基因表达框下游时,可以显著提高杆状病毒介导的基因的表达水平.为了进一步认识HS4作用的机制,构建了携带HS4绝缘子不同区域的6种重组病毒,比较了它们对报告基因egfp表达的影响.结果发现,相比对照病毒,插入HS4全长片段的重组病毒vBG-HS4-1200,以及同时插入250bp核心区域和400bp连接片段的重组病毒vBG-HS4-650在感染Sf9细胞后报告基因egfp的表达水平明显提高.这个结果与前人在哺乳细胞表达系统中所得出的结果基本相符,从而进一步证实HS4在裂解型病毒中同样可以通过表观遗传学修饰调控基因的表达.     

突变型绿色荧光蛋白基因在昆虫细胞和幼虫中的表达

用细菌－杆状病毒穿梭系统将一套含有绿色荧光蛋白基因和完整多角体蛋白基因的表达盒转座到ＡｃＮＰＶ－Ｂａｃｍｉｄ的Ｔｎ７转座接受位点,从而构建出一种带有ｇｆｐ基因和完整多角体基因的重组杆状病毒,用这一重组病毒感染细胞能稳定地殂多角体。     

电穿孔法基因转染哺乳动物细胞的应用

应用电穿孔技术转染pEGFP于哺乳动物细胞，讨论了电穿孔技术的应用条件，影响因素，初步确定了COS7、Hela、HepG2、K562、Jurkat等细胞系的转染条件，为今后的分子生物学研究打下了良好的基础。     

绿色荧光蛋白在分子细胞生物学研究中的应用

绿我荧光蛋白具有优良的特性,在蓝光或长紫外光的激发下,不需要任何外源底物或内源辅助因子的参入就能发出绿色荧光,绿色荧光蛋白基因的表达可用来监控活细胞或生物体中基因表达和蛋白质的定位,这是一个革命性的进展,而且,对基因ＤＮＡ序列的改造可能使绿色荧光蛋白的发光特性更加优良,从而共应用范围会更加广泛。     

DNA甲基化对杆状病毒极早期和滞早期启动子转录活性的影响

利用体外DNA甲基化酶和荧光素酶报告系统分析了DNA甲基化对杆状病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)的8个极早期和滞早期基因启动子表达活性的影响.研究结果表明,病毒极早期基因ie1和ie0启动子的活性受到甲基化修饰的强烈抑制,pe38启动子活性受到部分抑制;同时滞早期启动子p35、DNApol、lef1、lef3和lef8的启动子则在甲基化处理后得到一定程度的激活.转染的同时用AcMNPV感染细胞,在多数启动子中并没有改变甲基化处理对它们表达活性的影响,但使其影响程度有所减弱.在另一些启动子(pe38,p35,lef1)中,AcMNPV的感染使甲基化的作用基本消失.这些结果表明DNA甲基化对一些杆状病毒启动子的转录活性有一定的调控作用.     

哺乳动物细胞表达外源基因常用病毒载体的研究进展

文章概述了逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体等四种常用哺乳动物细胞表达外源基因的病毒载体系统的来源、组成、特点及应用方面研究的进展.     

EGFP和ALR融合基因表达载体构建及其在HeLa细胞中的表达

从人血液中提取总DNA,利用PCR技术扩增人肝细胞再生增生因子基因,将其插入表达载体pEGFP—C1的多克隆位点中,构建增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescence protein gene,EGFP）和人肝细胞再生增强因子（human augmenter of liver regeneration gene,ALR）融合基因表达载体pEGFP／ALR,并将其转染Hela细胞系,用含G418的DMEM／F12培养液筛选转基因细胞,然后利用PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测转基因细胞中ALR基因的存在及其表达,用荧光显微镜检测EGFP基因的表达．结果显示：得到了构建正确的EGFP和ALR融合基因表达载体;在转基因细胞中,PCR扩增得到1．7Kb的ALR条带,蛋白电泳得到57KD大小条带．与ALR和EGFP融合蛋白大小相符;荧光显微镜下观察到发绿色荧光的Hela细胞．在转基因细胞中,EGFP和ALR同时存在并表达,绿色荧光蛋白可作为报告基因指示目的基因的表达,从而简化了目的基因繁琐的检测手段．     

果蝇锌离子转运蛋白Catsup亚细胞定位分析

Catsup是果蝇体内一个功能重要的基因,其突变会导致体内多巴胺含量过高,引起果蝇致死及生殖障碍.绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)在确定蛋白的亚细胞定位进而在研究蛋白功能方面起着重要的作用.为了探索Catsup的亚细胞定位进而能够更好地研究Catsup的功能,文章利用基因工程技术和生物学方法,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增Catsup基因全长,与GFP一起连接至pUAST质粒,构建载体pUAST-Catsup-GFP,通过显微注射技术导入果蝇,获得UAS-Catsup-GFP转基因果蝇.通过克隆验证了转基因果蝇构建成功.利用该果蝇进行Catsup的亚细胞定位,确定其定位在高尔基体上,为进一步研究该基因的功能奠定基础.     

以UPS构建的酿酒酵母表达载体及GFP的表达

利用通用载体质粒融合系统UPS构建出了以GFP（绿色荧光蛋白）为报告基因的酵母表达载体，经PCR、电泳、测序等手段证明了构建的准确性，同时验证了UPS的高效性及简便性。     

哺乳动物细胞高效表达系统研究进展

哺乳动物细胞高效表达系统是生物制药工业中十分关键的环节,而表达载体和宿主细胞又是哺乳动物细胞表达系统的两个重要组成部分.文章较详细综述了通过目的基因整合位点的优化、增加目的基因拷贝数、提高目的基因的转录和翻译水平等构建哺乳动物细胞高效表达载体的研究进展.同时,为使宿主细胞更好地适应工业化大规模培养要求,对通过抗凋亡、细胞周期调控、糖基化、细胞增殖控制技术和多基因代谢等细胞代谢工程对其进行改造的研究进展也作了介绍.     

原癌基因c-raf在精原干细胞中的表达及作用

本研究用基因测序和BLAST检验扩增的精原干细胞DNA和c-raf的同源性;用MTT法观察c-rafASODNs(反义c-raf寡脱氧核甘酸)拮抗c-raf对体外培养精原干细胞培养的作用,探讨原癌基因c-raf对体外精原干细胞培养增殖的影响.实验结果显示扩增的精原干细胞DNA和c-raf的同源性98%;c-rafASODNs对体外培养的精原干细胞存活呈剂量依赖性抑制作用(P<0.05).提示c-raf在精原干细胞中表达;原癌基因c-raf促进精原干细胞体外培养的增殖.     

人神经营养因子-3在哺乳动物细胞中瞬时表达和稳定表达的初步研究

将人神经营养因子－3全长cDNA克隆入真核表达载体pcDNA3,分别COS-7儿CHO细胞中获得了瞬时表达和稳定表达，经大乳鼠脊髓背根神经节测活，瞬时表达和稳定表达产物均能明显促进其神经突起的生长，瞬时表达量约为10^-7g/mL，稳定表达量可达10^-8g/mL。     

滇西北8个民族群体面貌特征观察的聚类分析

滇西北怒江州、迪庆州等地是氐羌民族南迁的集散地。对当地独龙族、怒族、普米族、（拉玛）白族、福贡和维西的僳僳族、（康巴）藏族、纳西族等8个群体的面形、眼、鼻、唇、耳等5大类24项观察性特征进行了描述,以此计算了各群体间的遗传距离,与已报道的数据进行了聚类分析。发现滇西北氐羌群体面貌较一致,而其他地区的氐羌群体则不可避免地与别类群体进行过遗传交流,导致面貌趋近于外族。僳僳族和白族在迁徒中族内血统产生了很大的差异。就近居住的群体之间遗传交流往往是不可避免而且可观的。     

人胰岛素基因重组杆状病毒在家蝇中表达的研究

目的利用杆状病毒表达系统进行人胰岛素基因在家蝇中表达的研究.方法用携带有人胰岛素基因的重组杆状病毒感染家蝇幼虫,用放射免疫技术、Tricine-SDS-PAGE和Western-blot技术对蝇蛆胰岛素表达水平进行检测.结果重组的杆状病毒感染家蝇幼虫后,蝇蛆中有人胰岛素的表达,表达量为37.401μIU/mL,占蝇蛆总蛋白的0.583%.结论利用杆状病毒表达系统可以在家蝇蝇蛆中表达人胰岛素.     

小鼠造血干细胞的分离、培养及重组慢病毒载体介导的离体hFⅨ基因表达

造血干细胞是基因治疗理想的靶细胞之一,尤其适用于遗传性血液病.而重组慢病毒载体能高效感染造血干细胞,成为造血干细胞途径基因治疗的理想载体.从小鼠骨髓细胞中分离出单个核细胞(MNCs)进行体外悬浮培养,并用免疫磁珠法分离得到高纯度的小鼠Lin-CD117+造血干细胞(HSCs).体外悬浮培养期间,添加细胞因子的造血干细胞的细胞数和集落数逐渐增加,而未添加细胞因子的对照组的细胞数量无明显增加,细胞集落递减.用磷酸钙介导的共转染法制备了携带FⅨ基因的FUXW重组慢病毒,用慢病毒载体分别感染从ICR小鼠和C57小鼠中分离得到的MNCs,7d后测得细胞上清中hFⅨ的表达量分别为41.7±4.2和34.5±6.6ng/mL,而慢病毒感染C57小鼠造血干细胞,添加细胞因子组上清中hFⅨ的表达量为46.6±5.7ng/mL,不添加细胞因子组为33.3±4.8ng/mL.实验结果表明,重组FUXW慢病毒载体可有效感染小鼠单个核细胞和Lin-CD117+造血干细胞,添加细胞因子可提高转移基因的表达量.     

核糖体蛋白S3表达减少对果蝇发育的影响

为探讨核糖体蛋白S3在果蝇（Drosophila）发育中的作用,采用RNAi法,分别在果蝇和果蝇s2细胞中干扰核糖体蛋白S3表达,观察对果蝇表型的影响。结果显示,减少核糖体蛋白S3表达引起果蝇幼虫发育延迟,眼睛、翅膀和刚毛生长缺陷等。进一步实验表明,在翅原基中有明显的凋亡信号;S2细胞数目减少;细胞凋亡和细胞周期相关基因表达异常。上述结果暗示核糖体蛋白s3丧达减少导致的果蝇发育改变可能通过细胞凋亡的方式来实现。     

昆虫细胞中共表达人糖基转移酶对重组蛋白SEAP表达的影响

杆状病毒-昆虫细胞表达系统有表达量高及蛋白翻译后修饰较完善等特点,但与哺乳动物相比其缺乏几种关键的糖基转移酶.许多研究表明将哺乳动物的糖基转移酶基因转入昆虫细胞中,能使得昆虫细胞表达蛋白的修饰得到有效改善.本研究通过RT-PCR克隆了人Ⅱ型N-乙酰葡萄糖胺转移酶(β-1,2-N-acetylglucosaminyltransferaseⅡ)和Ⅰ型β-1,4-半乳糖基转移酶(β-1,4-galactosyltransferase)基因,并将它们分别插入重组杆状病毒上,获得了表达GnT2和β4GalT1的重组杆状病毒.以具有糖基化修饰位点的人分泌型碱性磷酸酶(Secreted Alkaline Phosphatase,SEAP)为对象,将表达糖基转移酶的重组杆状病毒和表达SEAP的重组杆状病毒共感染细胞,Western blot分析结果表明共感染时所表达的SEAP蛋白条带分子量明显大于其单独表达时的分子量.结果表明重组病毒共感染对杆状病毒-昆虫细胞表达的SEAP有修饰作用.