cDNA文库的差异筛选与抑制性减数杂交相结合分离胡萝卜体细胞胚根发育相关基因

应用cDNA文库差异筛选与抑制性减数杂交相结合的技术程序,并通过反向Northern分析进一步验证,成功地从解调控12h的胡萝卜体细胞胚的cDNA文库中,分离到7个在解调控12h特异表达的基因.其中4个含有完整的编码框,分别编码木质葡聚糖内转糖基化酶、脂肪酸去饱和酶、一种poly(A)结合蛋白和一种酰基转移酶.另外3个是5′端部分缺失的cDNA基因片段,分别编码三磷酸甘油醛脱氢酶、一种糖蛋白和一种与单链RNA/DNA结合的蛋白.对其中部分基因的Northern分析结果显示,它们的表达量在蔗糖调控下的胡萝卜体细胞胚根发育的不同时期均有显著变化,说明它们都是与胚根发育相关的基因.     

胡萝卜体细胞胚DnaJ同源基因的分离及其表达特性分析

DnaJ/Hsp40蛋白是DnaK/Hsp70的辅助分子伴侣,它通过调节DnaK/Hsp70的ATPase活性来影响蛋白复合体的合成与组装.运用改进的cDNA代表性差示分析方法从解调控胡萝卜体细胞胚中分离出DnaJ基因同源区段,进而以它为探针筛选解调控12 h的胡萝卜体细胞胚cDNA文库,从胡萝卜中分离得到DnaJ蛋白同源基因DcJ1.序列分析表明它的编码区为1257 bp,编码418个氨基酸和1个终止密码子,包含3个保守的特征结构域.Southern杂交分析表明,DcJ1基因在核基因组中以单拷贝或低拷贝形式存在;而Northern杂交则显示该基因仅在根中特异表达,其表达强度随着胡萝卜体细胞胚的调控-解调控过程发生明显的变化,并且不受热激的诱导.由此可见,DcJ1基因的表达活性与胡萝卜体细胞胚根的早期发育之间存在着明显的相关性.     

禽传染性支气管炎病毒H52反向遗传株的构建

IBV H52基因组全长27.6kb,分13个1.3~2.9kb的片段扩增H52全长cDNA,额外扩增N-3′片段,并克隆到载体PMD19-T上.利用No see′m技术在每个片段中引入BsaⅠ或BsmBⅠ酶切位点,D1片段中引入沉默突变位点,在5′UTR端和N-3′引入T7启动子,3′UTR端引入Poly(A)尾.将克隆好的13个片段酶切,纯化,体外无缝连接为全长cDNA.将全长cDNA及N-3′体外转录获得它们的转录体,将转录体共转染BHK-21细胞,48h后收获细胞液,将细胞液接种10日龄SPF鸡胚获得反向遗传株H52-R.在鸡胚中盲传5代后,通过RT-PCR对无义突变位点进行扩增及序列分析,在反向株H52-R中发现引入的无义突变位点.对反向株H52-R的一些生物学特性如HA、EID50等测定发现,H52-R的这些生物学特性与亲本株H52相似.     

人类基因组中L1元件及其5′UTR的研究

讨论了L1在人类染色体中的分布密度与染色体长度以及L1的密度与基因密度之间的关系.发现在大多数染色体上L1的密度和染色体的长度表现为正相关,而L1的密度和染色体中基因的密度表现为负相关;对人类L1的5′UTR进行了详细的研究后,发现在L1元件的5′UTR部分含有许多转录因子结合位点.对基因的转录起始位点上游进行统计分析,发现其中含有大量的L1序列.通过对人类的EST数据库进行BLAST分析,新发现了51条和人类L1 5′UTR相似性较高的EST片断,根据它们分布的组织特异性,说明L1元件可能调控与发育过程有关的基因的表达;最后应用多样性增量的方法对人类和大鼠的L1 5′UTR进行了区分,得到了较好的预测结果,说明大部分L1的5′UTR的调控作用是人类特有的.     

mRNA序列与相应UTR中内含子序列的相互作用

UTR区中的内含子对基因的表达调控过程发挥着重要的作用,它通过与相应mRNA的序列匹配方式发生相互作用并实现对基因的表达调控。采用Smith-Waterman算法进行局域比对,获得UTR区中的内含子与相应mRNA序列之间的最佳匹配片段。分析6个物种mRNA序列上最佳匹配片段的序列特征及匹配频率的分布规律,并分析这种相互作用分布的普适性。结果发现:最佳匹配片段的配对率和平均长度分布与siRNA和miRNA的结合特征一致; UTR区中的内含子与相应mRNA序列上的UTR序列存在较强的相互作用,低GC片段倾向与3′UTR区作用,而高GC片段倾向结合到5′UTR区。结论表明最佳匹配片段的序列特征符合RNA-RNA相互作用的一般规律,内含子序列应该是一类调控基因表达的功能片段。UTR区中的内含子与mRNA序列是协同进化的,通过相互作用完成应有的功能。     

硬叶兜兰花芽SSH文库的构建

以硬叶兜兰花芽cDNA为Tester,营养芽cDNA为Driver,利用SMART策略构建了硬叶兜兰花芽的抑制性消减杂交(SSH)文库.通过PCR对文库中插入的片段进行检测后,筛选了288个插入片段为500bp以上的克隆进行测序.测序结果去除载体序列后聚类得到18条差异表达片段,用BLAST进行比对分析表明,这些差异表达基因所编码的蛋白与光合作用、合成代谢、基因调控等功能有关,其中包括多个转座子和反转录转座子的同源基因.     

麻疯树胚乳cDNA文库的构建与分析

以等质量比的不同发育阶段的麻疯树（Jatropha curcas L.）胚乳为材料构建麻疯树胚乳cDNA文库.初级文库滴度为1.5×106 Pfu/mL，重组率为99.7％，插入片段大小为0.4～4 kb，平均约1 kb.全长基因的比例达到20％.推测的蛋白质序列种类主要包括贮存蛋白相关、转录表达调控相关、脂肪酸合成相关及信号传导相关等同源基因序列.编码功能基因的类型与分布情况同Joseph A White等构建的蓖麻胚乳cDNA文库基本一致，个别类型如贮存蛋白合成相关基因的比例相比较低，信号传导     

珠眉海棠（Malus zumi Mats）盐应答MzDREBb基因的克隆与功能研究

通过microarray（微列阵芯片）分析,从珠眉海棠盐胁迫cDNA文库中分离得到盐诱导的MzDREBb基因全长cDNA序列,研究苹果属植物DREB转录因子在胁迫中的作用。结果表明：MzDREBb全长1 185bp,开放阅读框共714bp,5′-UTR和3′-UTR的长度分别是121和350bp;MzDREBb编码237个氨基酸,有一个AP2/ERF结构域;系统分类将MzDREBb归入DREB家族的A-5亚组;MzDREBb定位在细胞核中,具有转录激活活性;半定量RT-PCR表明MzDREBb基因受到盐诱导。超表达MzDREBb基因的拟南芥耐盐能力增强。以上结果表明MzDREBb基因在盐胁迫应答中起重要作用。     

人和鼠脑cDNA文库的建立以及全长cDNA的批量分离

应用λZAP Express cDNA文库构建试剂盒构建了人3个月和8个月胎儿脑及大小鼠脑cD-NA文库.第2链cDNA经Sepharose CL-4B凝胶过滤层析后去除了较小的片段,使大片段cDNA具有较高的克隆效率.所建立的文库具有较长的插入片段.合并不同长度范围的人3个月胎儿脑cDNA片段,分别克隆入文库载体,获得了长片段、中片段、短片段及合并cDNA文库.从分级文库中各随机挑取300个克隆,经载体引物PCR扩增后,测定5'末端序列,一共获得894个表达序列标签(EST)序列.根据同源性比较结果将感兴趣的克隆环化后测定全长cDNA序列,得到了12条新的全长cDNA.这些文库的建立以及新EST,cDNA的分离为文库筛选和获得脑表达的新基因奠定了基础.     

禽传染性支气管炎病毒弱毒疫苗株H52反向遗传株的构建

IBV H52基因组全长27.6kb,分13个1.3-2.9kb的片段扩增H52全长cDNA,额外扩增N-3’片段,并克隆到载体PMD19-T上.利用No see’m技术在每个片段中引入BsaI或BsmBI酶切位点,D1片段中引入无义突变位点,在5‘UTR端和N-3’引入T7启动子,3’UTR端引入Poly（A）尾.将克隆好的13个片段酶切,纯化,体外无缝连接为全长cDNA.将全长cDNA及N-3’体外转录获得它们的转录体,将转录体共转染BHK-21细胞,48h后收获细胞液,将细胞液接种10日龄SPF鸡胚获得反向遗传株H52-R.在鸡胚中盲传5代后,通过RT-PCR对无义突变位点进行扩增及序列分析,在反向株H52-R中发现引入的无义突变位点.对反向株H52-R的一些生物学特性如HA、EID50等测定发现,H52-R的这些生物学特性与亲本株H52相似.     

杨树LEA基因家族全基因组鉴定及表达分析

从杨树基因组中鉴定LEA蛋白家族成员,并分析基因在杨树各组织以及在种子形成、吸涨及萌发过程中的表达情况.从NCBI下载拟南芥、水稻以及大豆等植物的LEA蛋白家族成员,通过blastP程序从杨树基因组中鉴定出候选基因,并采用pfam程序进行进一步筛选获得杨树LEA蛋白基因,最后通过芯片以及EST数据分析基因的表达量.通过对杨树LEA蛋白基因家族在全基因组水平上的搜索,确定了杨树LEA蛋白家族8个亚家族,共87个成员,发现在花中有16个基因高量表达,且其中8个基因具有很高的组织特异性.在吸涨种子中,PtLEA1.1和PtLEA3.1有高量的表达,LEAⅣ,LEAⅤ,LEAⅥ及SMP亚家族成员都具有特异的表达.12个基因在萌发种子中有高量的表达,其中4个基因特异表达,5个基因在种子萌发过程中可能受到光照的影响.此外,3个基因在成熟叶片中出现了下调表达,8个基因在根中具有高量表达,3个基因的高量表达在木质部中被发现.杨树LEA蛋白不同亚家族成员可能参与了植物种子的生长发育、种子的萌发及对胁迫的响应等多种生理功能.     

筛选与拟南芥绒毡层发育过程中重要的转录因子DYT1相互作用的调控蛋白因子

DYT1是拟南芥绒毡层发育过程中重要的转录因子.DYT1的缺失会导致绒毡层相关功能的缺陷.然而,DYT1并不是使绒毡层功能化的充分因素,暗示了DYT1蛋白需要和其他转录因子形成复合物才能发挥功能.利用酵母双杂交技术以DYT1蛋白为诱饵在拟南芥cDNA文库中筛选与DYT1相互作用的蛋白.通过筛选从文库中得到20个阳性克隆,通过BLAST序列比对得到8个候选基因序列,从中鉴定出6种候选基因编码可能的转录因子或者其他调控转录的蛋白因子.其中5个编码调控因子的基因都被证实在花药中表达.更进一步,发现另一个对花药发育所必需的转录因子AMS能与DYT1在酵母体内形成转录复合物.表明这2个蛋白可能形成异源复合物在花药中共同调节下游基因的表达.     

果蝇成熟mRNA序列与其相应内含子序列的匹配特征分析

研究成熟mRNA序列与其相应内含子序列的相互作用规律对于揭示基因表达调控具有重要意义.本文以黑腹果蝇第一号染色体蛋白质编码基因序列为研究对象,采用SmithWaterman局域比对的方法,在mRNA序列和内含子序列之间进行匹配性比对分析.研究发现剪切后的内含子序列与基因的5′UTR序列和3′UTR序列的相对匹配频数高于编码(CDS)序列.最佳匹配片段集合的G+C含量分布范围很广,其分布中心与3′UTR序列最为接近,5′UTR序列次之,距离CDS序列最远,这是导致两端UTR序列与内含子序列有较高匹配强度的原因.最佳匹配片段的配对率主要分布在68%～75%之间,最可几长度为20bp左右,最佳匹配片段的序列特征与miRNA相似.结果显示内含子与mRNA之间的这种匹配模式是参与基因调控的一种可能方式.     

RLM-RACE法快速克隆盐角草胆碱单加氧酶cDNA 5′末端全序列

采用RLM-RACE法,根据已获得的盐角草胆碱单加氧酶基因的部分序列,设计2条特异性嵌套PCR引物,成功地克隆了该基因cDNA 5′末端全序列,测序结果显示该片段包括5′UTR 154个核苷酸和编码区606个核苷酸,编码N端202个氨基酸,Blast P结果表明,该片段编码的蛋白序列与辽宁碱篷及其他藜科植物的胆碱单加氧酶同源性达到85％以上,同时找出了其转录起始位点,即为该序列的第1个碱基g．     

miRNA与其靶mRNA 3′UTR序列的匹配特征分析

MicroRNA是调控基因表达的重要功能片段,它们在动植物的生长发育、疾病发生过程中发挥着重要的作用。基于miRecords数据库,以人类、小鼠和大鼠实验验证的miRNA和它们的靶mRNA 3′UTR序列为研究对象,分析了miRNA和其匹配片段在3′UTR序列上的位置偏好性。研究发现,miRNA与3′UTR序列相互作用的位置存在区域偏好。低G+C含量的miRNA主要作用在3′UTR序列的5′端和3′端,高G+C含量的miRNA主要作用在3′UTR序列的5′端。低G+C含量的匹配片段在3′UTR序列上没有明显的位置偏好,而高G+C含量的匹配片段集中分布在3′UTR序列的5′端。低配对率的匹配片段主要分布在3′UTR序列的两端,中等配对率的匹配片段主要分布在3′UTR序列的5′端。此外,还分析了miRNA与匹配片段的4种相互作用方式中配对率的差异。研究对于揭示miRNA对基因表达调控的多样性提供了新的思路。     

日本七鳃鳗口腔腺分泌蛋白BGSP-2的序列进化分析、基因克隆及诱导表达

从实验构建的七鳃鳗口腔腺cDNA文库中获取BGSP-2(buccal gland secretion protein)基因片段,并对其进行生物信息学分析.RT-PCR扩增,已获得日本七鳃鳗口腔腺BGSP-2蛋白的全序列cDNA,将目的基因与pET23b载体连接,进一步转化至Rosetta表达菌株中,筛选阳性克隆,对包涵体进行变性、复性与纯化.结果显示已成功获得成分均一的活性蛋白.     

烟草尼古丁去甲基酶基因CYP82E4启动子结合蛋白的鉴定与分析

 以尼古丁去甲基酶编码基因（CYP82E4）上游的启动子功能元件作为诱饵,使用酵母单杂交方法从喷施乙烯利叶片的cDNA融合表达文库中钓取与之相互作用的结合蛋白.研究结果表明,诱饵载体pHIS2/pE4和cDNA融合表达载体pGADT7-Rec2共转化到酵母细胞中的效率为1×10⁶.对文库的筛选结果表明,本研究共获得39个阳性克隆,且阳性克隆的插入片段在850～2500bp之间.将获得的39个阳性克隆进行测序,其中发现1个可能参与基因(CYP82E4）表达调控的锌指蛋白转录因子.下一步将对其功能进行分析,为通过分子育种手段培养低含量去甲基尼古丁的烟草提供实验基础.     

异源四倍体鲫鲤Sox4基因部分序列及其5′端调控区启动子片段的克隆与分析

通过PCR技术从异源四倍体鲫鲤基因组DNA中分离到Sox4基因部分基序.序列分析表明,其5′端调控区具有多种启动子所特有的序列元件,如TATA框,CAAT框等,据此推测,它具有启动子活性.采用高保真PCR方法克隆了异源四倍体鱼Sox4基因5′端调控区600bp启动子片段,将其插入启动子缺失的增强绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pEGFP-1中,构建重组载体pAtsox4EGFP-1.通过瞬时转染HeLa细胞,在倒置荧光显微镜下可检测到绿色荧光.结果表明,克隆的Atsox4基因5′端调控区具有启动子活性,并成功构建了含四倍体鱼Sox4基因启动子片段的报告基因载体,为以后研究Sox4基因表达调控的分子机制奠定了基础.