研究蛋白质相互作用的新系统——酵母双杂交系统

自酵母双杂交系统创建以来,已经成为研究蛋白质相互作用的重要手段,被广泛用于各个生物学研究领域,揭示了大量未知蛋白质之间的相互作用,近来,在经典的酵母双杂交系统基础上,又相继提出许多新的研究方法,如：三杂交系统,单杂交系统,逆向双杂交系统,ＳＯＳ富集系统等,酵母双杂交及其衍生系统已经成功地运用于蛋白质之间,蛋白南与ＤＮＡ、ＲＮＡ、配体之间的相互作用的研究。     

酵母双杂交技术筛选与Axin相互作用的蛋白质

肿瘤抑制因子Axin以构架蛋白的形式通过Wnt、JNK、p53、TGF-β、G蛋白等众多信号转导途径参与细胞生长、增殖、分化和凋亡等多种重要细胞命运的调控过程.为了发现Axin新的相互作用蛋白,进一步研究Axin的多功能性,作者通过酵母双杂交技术,将Axin1基因从SpeI单一酶切位点到3′末端的DNA序列构建到pGBKT7载体作为诱饵,对小鼠脑的cDNA文库进行筛选,最后获得28个阳性克隆.通过对这些克隆的测序和对所得序列的生物信息学分析,得到13个与Axin的C末端相互作用的蛋白质,这些蛋白主要参与胚胎发育,肿瘤形成,蛋白翻译后修饰等生物学过程的调节.这一结果为进一步研究Axin的新功能提供了很好的线索.     

酵母双杂交系统筛选与HCMV pUL23蛋白相互作用的蛋白质

将UL23基因的ORF序列克隆到酵母表达载体pGBKT7构建诱饵质粒pGBKT7-UL23,用酵母双杂交技术筛选人胚肾cDNA文库中与人巨细胞病毒pUL23相互作用的宿主蛋白分子,再通过回复酵母双杂交再次确认两者之间的相互作用.结果表明:酵母双杂交,回复酵母双杂交试验证明宿主蛋白分子elF3e(eukaryotic trans-lation initiation factor 3,subunit E interacting protein)能够与人巨细胞病毒UL23蛋白相互作用.宿主蛋白分子elF3e能够与人巨细胞病毒UL23蛋白相互作用,这为进一步研究pUL23蛋白在HCMV生活周期中的作用机制提供依据.     

利用酵母双杂交筛选与谷氨酰tRNA合成酶相互作用的蛋白质的初步研究

使用拟南芥作为模型,采用筛选出和谷氨酰tRNA合成酶有相互作用的蛋白质的方法研究谷氨酰tRNA合成酶在植物中可能具有的未知功能.首先利用反转录PCR方法获得拟南芥的cDNA,然后通过酵母双杂交系统,用拟南芥的谷氨酰tRNA合成酶作为诱饵对拟南芥cDNA文库进行筛选,并获得多个阳性菌落.对该菌落进行进一步的鉴定得到和谷氨酰tRNA合成酶具有相互作用的蛋白质,这对进一步研究谷氨酰tRNA合成酶及其相互作用蛋白质参与的生命活动奠定基础.     

酵母双杂交系统的改进和发展

酵母双杂交系统是研究蛋白质间相互作用的一种非常有效的分子生物学方法，具有快速和高效的特点，但也存在一些局限性．人们针对它的缺点相应地进行了一些完善和改进，并衍生出单杂交系统、三杂交系统等一系列相关的技术，从而拓宽了该系统的应用领域．     

酵母双杂交筛选与视黄醇结合蛋白有相互作用的蛋白质

为了研究视黄醇结合蛋白(RBP)在维生素A代谢调控中的作用和与相关疾病发生、发展的关系,以RBP作为诱饵基因构建了融合表达载体pGBKT7-RBP;在排除自身转录激活活性的基础上,与人肾脏cDNA预转库融合筛选(Pretransformed MATCHMAKER Lbraries),经营养缺陷型和X-α-gal显色鉴定,从中筛选出三种与RBP有相互作用的新蛋白质,并从人睾丸cDNA库中克隆了这三个基因的全长序列。     

应用酵母双杂交系统筛选与NAP1相互作用的蛋白质

用NAP1作为"诱饵"蛋白,通过酵母双杂交系统筛选人淋巴细胞cDNA文库,鉴定阳性克隆;再利用酵母双杂交和免疫共沉淀验证相互作用. 结果表明,通过酵母双杂交系统筛选人淋巴细胞cDNA文库,阳性克隆的鉴定,发现了与NAP1的相互作用蛋白质―蛋白酶体α亚基3(PSMA3). 免疫共沉淀(Co-IP)结果证实外源表达的NAP1蛋白和PSMA3蛋白在293T细胞中有特异性的相互作用. NAP1作为FDC分泌的一种多肽,与PSMA3有特异性的相互作用,这种相互作用如何实现对蛋白酶体降解靶蛋白的活性调节,其作用机理有待深入研究.     

酵母双杂交系统的应用与改进

酵母双杂交系统是一种体内研究蛋白质相互作用的非常有效的分子生物学方法,自建立以来得到了不断的改进与发展,并衍生出单杂交系统、三杂交系统、方向杂交系统等一系列相关技术,在蛋白质组学及药物开发研究中发挥了重要作用。     

酵母双杂交技术的发展

自酵母双杂交系统创建以来，已经成为研究蛋白质相互作用的重要手段，被广泛用于各个生物学研究领域，揭示了大量未知蛋白质之间的相互作用。近年，在经典的酵母双杂交系统基础上，针对其局限性，相继提出许多新的研究方法，如：双（多）筛选法，SOS富集系统，哺乳动物细胞双杂交系统，三杂交系统，单杂交系统，逆向双杂交系统，等等。本将对上述方法进行详细叙述。酵母双杂交及其衍生系统已经成功地运用于蛋白质之间，蛋白质与DNA、PNA、配体之间的相互作用的研究。     

酵母双杂交技术的应用与发展

酵母双杂交技术是一种有效的真核活细胞内研究方法,在蛋白质相互作用的研究方面得到了广泛的应用并取得了许多有价值的重要发现。作为一个完整的实验系统,它自建立以来经过了不断的改进与完善,不仅进一步提高了实验结果的可靠性与精确性,而且在此基础上又发展了反向双杂交,三杂交及核外双杂交等多项技术。     

用酵母双杂合系统筛选与人血小板生成素受体c-Mpl相互作用的蛋白质的初报

血小板生成素（ｔｈｒｏｍ ｂｏｐｏｉｅｔｉｎ, ＴＰＯ）是调节血小板生成最主要的细胞因子,其生物学效应由其受体ｃ－Ｍｐｌ介导．利用酵母双杂合系统（ｔｗ ｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ ）筛选与ｃ－Ｍｐｌ相互作用的蛋白质因子,以Ｇａｌ４ ＢＤ融合ｃ－Ｍｐｌ膜内部分ｃＤＮＡ 的ｐＡＳＭＭ 为靶蛋白质粒,筛选了人胎盘ｃＤＮＡ 文库,分离到人波形纤维蛋白（ｖｉｍ ｅｎｔｉｎ）的部分编码序列,首次检测到波形纤维蛋白与ＴＰＯ 受体之间的相互作用,这提示细胞骨架蛋白可能在ＴＰＯ 的信号转导过程中起着重要的作用     

酵母双杂交系统检测金属硫蛋白(MT)间的相互作用

金属硫蛋白-3(MT-3),又称神经生长抑制因子,为金属硫蛋白家族中惟一具有生物活性的成员。为了验证其在细胞内是否形成二聚或多聚体,构建酵母双杂交系统用于检测。结果表明：MT-3与MT-3之间在酵母细胞内能发生相互作用,进一步用酵母双杂交实验还表明MT-3与MT-1间也存在弱相互作用。由此提示,在机体细胞中,MT-3可以以同源或异源二聚体的形式存在。     

利用酵母双杂交系统筛选与BnSmD1相互作用的蛋白

本研究以油菜BnSmD1为诱饵蛋白,利用酵母双杂交技术,从甘蓝型油菜cDNA文库中筛选出与之有相互作用的Arf-GTP酶激活蛋白1(Brassica napus ADP-ribosylation factor GTPase activating protein1,BnArf GAP1),采用RT-PCR扩增并克隆到3个油菜Arf GAP基因的开放阅读框全长序列,BnArf GAP1、BnArf GAP2和BnArf GAP3.BnArf GAP1和BnArf GAP2都拥有1个507bp的开放阅读框,编码168个氨基酸残基;与前两个基因相比,BnArf GAP3核苷酸序列中插入了一个93bp的带有终止密码子的外源片段,导致翻译的提前终止,它拥有1个249bp的开放阅读框,编码82个氨基酸残基.BnArf GAP1和BnArf GAP2核苷酸序列一致性达到98.22％;BnArfGAP1与BnArf GAP3核苷酸序列一致性达到82.83％,BnArf GAP2与BnArf GAP3核苷酸序列一致性达到84.17％.BnArf GAP1、BnArf GAP2和BnArf GAP3都含有一个C2结构域.     

酵母双杂交系统测定抗雌激素物质

建立了用酵母双杂交系统筛选具有抗雌激素作用物质的生物测试法,并对6种工业用酚类物质(4-n-壬基酚,2-sec-丁基酚,2-羟基联苯,3-叔丁基酚,2-叔丁基酚和4-乙基2,6-二叔丁基酚)及氯化三苯基锡的抗雌激素作用进行了测试。结果表明：氯化三苯基锡显示出极强的抗雌激素作用,强度超过了抗乳癌剂三苯氧胺及其代谢产物4-羟基三苯氧胺。可以推测出有机锡造成软体动物的雄性化作用可能是由其抗雌激素作用引起的。6种酚类物质中,除4-乙基-2,6-二叔丁基酚外,其他5种显示出弱抗雌激素作用。值得注意的是：当4-壬基酚显示出雌激素促进作用时,4-n-壬基酚却显示出抗雌激素作用。     

应用酵母双杂交技术筛选与p53相互作用的蛋白质

应用酵母双杂交技术筛选与p53发生相互作用的蛋白质,有助于进一步阐明其在肿瘤发生、发展中发挥重要作用的调控机制。采用酵母双杂交技术,以p53C末端（62-393aa）作为诱饵筛选人乳腺cDNA文库,寻找能与之相互作用的蛋白质．并运用报告基因等实验提供的信息,经过重复验证排除假阳性以确定最后的阳性克隆。以p53C末端（62～393aa）作为诱饵最终筛选出了一个阳性克隆,经测序及生物信息学分析,这一个阳性克隆为：PIAS3（Protein inhibitor of activated stat3）。说明了PIAS3蛋白能与p53（62-393aa）发生特异性的相互作用。     

肝核转录因子FOXA3相互作用蛋白的初步研究

FOM3基因足肝核转录因子（Hepatocyte Nuclear Factor,HNF）基因家族中含有Foxhead Box结构域的3个成员之一,在维持血糖平衡以及调控发育方面发挥着重要的作用,利用FOXA3-AD酵母双杂交载体筛选人肝cDNA-BD酵母双杂交文库,并通过共转化进行验证,获得了两个与NFOXA3相互作用的蛋白：C3和TMEM4．这些相互作用蛋白的发现为深入了解FOXA3蛋白参与糖代谢调控的分子机制提供了线索．     

酵母菌发酵产蛋白质条件的研究

从新疆吐鲁番土壤中筛选出三株酵母菌,在不同的培养基、温度和pH条件下对它们的产蛋白质量进行了研究,从中筛选出产蛋白质量较高的菌株Sy95-001,这将对生产具有一定的实践意义。     

利用酵母Two-hybrid系统筛选编码产物与p53相作用的人类基因

用酵母ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ系统在人胚胎脑组织ｃＤＮＡ表达文库中寻找编码产物与ｐ５３相互作用的基因。在１．５×１０６个转化子中筛选到６８个初级阳性克隆。通过测定转化子第二轮β－半乳糖苷酶活力发现，人胚胎脑组织ｃＤＮＡ表达文库中有一个阳性克隆中的ｃＤＮＡ编码产物与ｐ５３反应结果为明显阳性，说明两个蛋白之间存在较强的相互作用。用热测序法测得这段ｃＤＮＡ的序列通过查询基因数据库发现，这段ｃＤＮＡ编码人的泛肽交联酶，可认为是泛肽交联酶参与ｐ５３在细胞内浓度的调节。     

可用于制作波分复用器的非水溶性绿敏光致聚合物的研究

对一种非水溶性绿敏光致聚合物全息记录材料用作全息光栅型波分复用器进行了研究.该聚合物体系由单体、成膜物、引发剂、链转移剂及光敏剂等成分组成,它具有防潮、后处理简单、灵敏度较高和对514.5nm绿光敏感等特点.利用这种光致聚合物制作了适用于光栅型波分复用器的透射式全息光栅.根据研究,在理论上论证了该光致聚合物制作的全息光栅型波分复用器可以实现14~56个通道的复用和解复用,并认为该材料可以用来制作光栅型波分复用器.