大豆11S球蛋白基因Gy1启动子克隆及序列分析

以高蛋白大豆品种南农87C-38总DNA为模板,采用PCR法扩增获得约1100bp大小的DNA片段,回收该片段并克隆到puCm-T载体上,选取阳性克隆进行PCR和酶切检测,再进行测序分析.序列分析显示该片段含1174个核苷酸,采用Vector NTI软件将试验中克隆的序列与GenBank E07850报道的Gy1启动子和GenBank X15121报道的Gy1启动子及信号肽对应序列分别进行比对,同源性分别为99.6%和99.3%.确定该片断为南农87C-38大豆11S球蛋白基因Gy1启动子及信号肽.该启动子的成功克隆,可为今后利用基因工程技术改良大豆种子营养品质研究奠定基础.     

水稻中受硝酸盐诱导的基因启动子的克隆与植物双元表达载体的构建

为克隆水稻中受硝酸盐诱导的基因启动子,从GeneBank中找到了6组水稻中受硝酸盐诱导的特异cDNA片段,结合已发表的硝酸盐诱导的相关基因,经过序列比对确定特异片段所在的基因.电子克隆出对应基因的5′侧翼约1 500 bp的序列.以总DNA为模板利用PCR技术克隆出了对应的5′侧翼序列.经过测序分析,该序列具有许多启动子特征的顺式作用元件,加TA-box,CpG岛等.将这些启动子序列连接到pCAMBIA1391Z双元载体中,构建植物双元表达载体以进行启动子活性检测.     

水稻花粉特异性启动子的克隆与表达

利用PCR技术,从水稻幼苗总DNA中扩增并克隆了一段DNA片段。将该片段与报告基因GUS基因融合,构成植物表达载体。经农杆菌转化烟草萌发花粉,共培养约24h后,作瞬时表达检测。结果表明,该克隆片段具有启动子功能。DNA序列分析表明,该克隆片段长度为526bp,含有TATA盒及CAAT盒。与原基因（PSI）启动子序列比较,同源性为52％。部分顺式调控元件相同。     

黑线仓鼠MHCⅡ类DQA基因外显子2的克隆与序列分析

为了探明黑线仓鼠MHC的结构与功能并寻找分子标记,对MHCⅡ类DQA基因的外显子2进行克隆和序列分析．提取黑线仓鼠3个群体（吴村、沂南和临朐）的基因组DNA构建基因池,利用PCR技术扩增得到249bp的片段,将该目的片段连接到pMD18-T载体中,重组质粒转入大肠杆菌DH5α后利用蓝白斑法筛选阳性克隆,测序后得到该目的片段的核苷酸序列（Genbank登录号：FJ209306）并推导出氨基酸序列．结果表明：黑线仓鼠、人类、大鼠、小鼠、猪、马、牛、兔之间DQA基因外显子2的核苷酸序列同源性为68．7％-85％,氨基酸序列同源性为56．8％-83．5％,黑线仓鼠与大鼠、小鼠亲缘关系更近．测序得到的OQA基因外显子2的序列在物种间具有丰富的多态性,可以作为物种遗传分析的分子标记．     

野生一粒小麦着丝粒RCS1相关序列的克隆鉴定

用水稻着丝粒重复序列RCS1为探针 ,与 30 72个克隆进行菌落杂交 ,得到了 32个阳性克隆 ,用RCS1与拟斯卑尔脱山羊草着丝粒重复序列Tcs2 5 0为探针进一步筛选 ,在 32个RCS1相关的阳性克隆中任选 10个克隆进行点杂交 ,分别有 6个和 5个阳性克隆 .为了克隆RCS1相关片段 ,依据RCS1的序列设计了三对引物 ,将引物 3从上述阳性克隆中扩增的一个 5 4 3bp的片段克隆测序 ,发现与水稻RCS1部分片段达到约 83%的同源 ,与大麦的反转座子 (Ty3 gypsy)部分序列同源性达到了 92 % ,与节节麦中着丝粒的整合酶基因部分序列同源性达到了 96 % ,命名为TBRCS1.TBRCS1可能是野生一粒小麦着丝粒区的组成部分     

PRV广东株gE基因去信号肽片段的克隆与序列测定

根据伪狂犬病病毒（PRV）Rice株gE基因的序列设计并合成了1对引物,以我国PRV地方毒株广东株的基因组DNA为模板,通过PCR方法获得了一大小约1.6kb的DNA片段,并将其克隆到pMD18-T载体上进行测序,序列测定结果显示,该片段长1665bp,编码555个氨基酸,与PRV Rice株gE基因的核苷酸序列同源性为97.7%,氨基酸序列同源性为95.9%。     

山楂Actin基因片段克隆及序列分析

依据GenBank中已知的蔷薇科梨属Actin基因的保守序列设计1对特异性引物,以山楂叶片总DNA和总RNA为模板,分别利用PCR和RT-PCR技术从山楂中克隆得到Actin基因的DNA片段和cDNA片段,测序得到山楂Actin基因DNA片段长度为1 578 bp,cDNA片段长度为1 005 bp,编码334个氨基酸。生物信息学软件分析表明,该核苷酸序列与苹果、梨、桃的Actin基因同源性较高,分别为98%,97%,95%,而编码的氨基酸序列与苹果、梨、桃则完全相同,属间具有很好的保守性。试验克隆得到的基因为山楂Actin基因,命名为CpActin。进化树分析结果进一步表明,该Actin序列与苹果、梨、桃和草莓等亲缘关系最近;半定量RT-PCR结果显示,CpActin在山楂的叶片、花柱和花粉中能够稳定表达,可作为山楂的内参基因。     

杂色鲍肌动蛋白启动子的克隆与序列分析

杂色鲍(H.diversicolor diuersicolor)是我国华南地区重要的海水养殖对象,作为利用转基因技术改良杂色鲍品质研究工作的首要部分,作者利用PCR和染色体步移(Genome Walking)方法克隆了杂色鲍肌动蛋白基因编码区部分序列和启动子序列(GenBank登陆号:EU622901).所分离的肌动蛋白基因DNA序列片段全长为1 990 bp,与GenBank中彩虹鲍(Haliotis iris)肌动蛋白A1基因序列和肌动蛋白A1a基因序列有非常高的相似性(99%和96%).在基因编码区中间发现了一个内含子区,在编码区之前发现一个类启动子区,经过Promoter Prediction在线软件分析,发现了该启动子序列和转录起始位点,同时也发现了该启动子特有的启动元件两个标准的CAAT BOX和一个TATA BOX.这些实验结果表明所克隆的杂色鲍肌动蛋白和启动子序列符合实验的目的.并且这一实验的成功也为下一步利用所分离的启动子做杂色鲍转基因工作打下基础.     

广西巴马小型猪生长激素(pGH)基因全序列克隆及序列分析

目的克隆广西巴马小型猪生长激素(pGH)基因全序列,并与已发表的其它品种猪的生长激素(pGH)基因全序列进行比较,探讨该基因在广西巴马小型猪中可能存在的变异。方法以广西大学巴马小型猪基因组DNA为模板,扩增巴马小型猪生长激素基因的全序列,将该扩增片段亚克隆到pMD18-T载体后测序。再将测序结果在NCBI进行BLAST。结果测序结果证明克隆得到了巴马小型猪GH基因,全长为2 007 bp。同源性比较发现,巴马小型猪GH基因全序列与GenBank中发表的五指山猪、太湖猪及普通猪的GH基因全序列的同源性分别为99.4%、98.3%、93.9%。     

青海牦牛与云南牦牛乳球蛋白基因5′调控区核苷酸序列同源性比较

利用一对PCR引物,寡聚核苷酸序列的上游引物为5-′gCg,AAT,TCA,TCC,CAC,gTg,CCT,gC-3;′下游引物为5-′gAg,AAT,TCC,Tgg,ggA,ggg,ACC,TT-3′。经68℃退火及30轮循环的PCR程序后,分别克隆来自我国青海和云南地区牦牛的乳球蛋白基因的5′调控区1 447 bp的DNA片段。将该片段从琼脂糖凝胶中回收,克隆在pMD18-T Vector后进行序列测定。序列分析结果表明,青海牦牛该序列的核苷酸序列与文献报道的奶牛该基因的同源性为97.65%,云南牦牛该序列的核苷酸序列与奶牛该基因的同源性为96.8%,青海牦牛与云南牦牛该基因片段的核苷酸序列同源性为99.4%。     

按大肠杆菌高表达序列设计的人干扰素α-2b基因的化学合成和克隆

根据大肠杆菌高表达序列重新设计了人干扰素α-2b基因编码区的核苷酸序列,应用化学合成的方法合成了多个互补DNA片段,经互补片段分别退火和连接后,将完整编码区分两段分别克隆于pUC19质粒中,进行DNA序列分析,分别选取序列完全正确的两种克隆片段进行重组.获得了与设计序列完全一致的含有完整编码区的人干扰素α-2b基因.     

野生－粒小麦着丝粒RCS1相关序列的克隆鉴定

用水稻着丝粒重复序列RCS1为探针，与3072个克隆进行菌落杂交，得到了32个阳性克隆，用RCS1与拟斯卑尔脱山羊草着丝粒重复序列Tcs250为探针进一步筛选，在32个RCS1相关的阳性克隆中任选10个克隆进行点杂交，分别有6个和5个阳性克隆．为了克隆RCS1相关片段，依据RCS1的序列设计了三对引物，将引物3从上述阳性克隆中扩增的一个543bp的片段克隆测序，发现与水稻RCS1部分片段达到约83％的同源，与大麦的反转座子(Ty3／gypsy)部分序列同源性达到了92％，与节节麦中着丝粒的整合酶基因部分序列同源性达到了96％，命名为TBRCS1．TBRCS1可能是野生一粒小麦着丝粒区的组成部分．     

桃抗病基因同源序列的克隆与分析

根据已克隆的STK类抗病基因的保守区设计简并引物对4个不同桃的基因组DNA进行PCR扩增,将获得的扩增片段的回收产物,应用pGEM-T easy裁体试剂盒进行了目的基因片段的克隆.随机挑取若干单克隆经PCR鉴定确认后,进行测序,共获得11个各不相同的片段序列.氨基酸序列分析中,有6个片段能推导出完整的氨基酸序列.除了两侧都基本具有STK类抗病基因产物的保守结构域.     

绵羊角蛋白关联蛋白KAP6-1基因5′端调控区的分子克隆及测序结果比较

根据绵羊毛囊角蛋白关联蛋白(KAP 6-1)基因已知DNA序列设计合成了两个特异性引物,以绵羊基因组DNA为模板,PCR扩增出1 042 bp的特异性片段,连接到pM D 19T载体中获得该片段克隆.经过快速提质粒法筛选、限制性内切酶分析表明该克隆包含所需的目的片段.DNA测序结果也证明该克隆片段与原基因5′端调控区序列相比具有很高的一致性.研究结果为今后制备转基因克隆动物,在毛囊细胞中特异性表达绒毛生长调控基因奠定了基础.     

Balb/C小鼠金属硫蛋白-1 cDNA的克隆及序列分析

以 RNA一步提取法 ,采用 RT-PCR技术成功地将 Balb/ C小鼠金属硫蛋白 -1 c DNA基因片段克隆于质粒 p UC-1 9上 ,并对克隆片段 c DNA进行核苷酸序列测定     

青海牦牛与云南牦牛乳球蛋白基因5''''调控区核苷酸序列同源性比较

利用一对PCR引物，寡聚核苷酸序列的上游引物为5’-gCg，AAT，TCA，TCC，CAC，gTg，CCT，gC-3’；下游引物为5’-gAg，AAT，TCC，Tgg，ggA，ggg，ACC，TT-3’。经68℃退火及30轮循环的PCR程序后，分别克隆来自我国青海和云南地区牦牛的乳球蛋白基因的5’调控区1447bp的DNA片段。将该片段从琼脂糖凝胶中回收，克隆在pMD1S-T Vector后进行序列测定。序列分析结果表明，青海牦牛该序列的核苷酸序列与文献报道的奶牛该基因的同源性为97．65％，云南牦牛该序列的核苷酸序列与奶牛该基因的同源性为96．8％，青海牦牛与云南牦牛该基因片段的核苷酸序列同源性为99．4％。     

猕猴肉瘤病毒SV40 T-ag-C 基因克隆及序列分析

摘要: 目的对来源于一株自然感染猕猴肉瘤病毒SV40 的猴肾细胞培养物进行大T 抗原C-羧基端( T-ag-C) 基因 克隆及核苷酸序列分析。方法采用PCR 法分别从一株自然感染SV40 病毒的猴肾细胞培养物和SV40776 标准 株接种的vero 细胞培养物提取的总DNA 中扩增出441bp 的SV40 大T 抗原C-羧基端( T-ag-C) 基因片段,分别将其 克隆到PMD18-T 载体中,转化至JM109 感受态大肠杆菌细胞后,挑取阳性克隆进行测序鉴定,并对获得的目的基 因核苷酸序列进行序列分析及同源性分析。结果来源于猴肾细胞培养物的SV40 大T 抗原片段与本实验室来源 于云南野生猴群的猕猴外周血所得到的SV40 大T 抗原片段同源性为97. 31% ,与GenBank 中登录号为NC _ 001669. 1 序列进行比对,同源性为96. 33% ; 与SV40-776 标准株接种的vero 细胞培养物所扩增的大T 抗原片段同 源性为97. 55% 。结论对大T 抗原基因克隆和序列分析是了解和掌握SV40 病毒分子流行病学及其变异趋势的 重要手段。     

RLM-RACE法快速克隆盐角草胆碱单加氧酶cDNA 5′末端全序列

采用RLM-RACE法,根据已获得的盐角草胆碱单加氧酶基因的部分序列,设计2条特异性嵌套PCR引物,成功地克隆了该基因cDNA 5′末端全序列,测序结果显示该片段包括5′UTR 154个核苷酸和编码区606个核苷酸,编码N端202个氨基酸,Blast P结果表明,该片段编码的蛋白序列与辽宁碱篷及其他藜科植物的胆碱单加氧酶同源性达到85％以上,同时找出了其转录起始位点,即为该序列的第1个碱基g．     

我国不同地域牦牛BLG基因部分核苷酸序列同源性分析

设计一对PCR引物，寡聚核苷酸序列的上游引物为5’-gCg，AAT，TCA，TCC，CAC，gTg，CCT，gC-3’，下游引物为5’-gAg，AAT，TCC，Tgg，ggA，ggg，ACC，TT-3’。经68℃退火及30轮循环的PCR程序后，分别克隆了来自我国甘肃、青海和云南地区牦牛β乳球蛋白基因的5’调控区1447bp的DNA片段。将该片段从琼脂糖凝胶中回收，克隆在pMD18-T Vector后进行序列测定。序列分析结果表明，甘肃牦牛与青海牦牛该序列的核苷酸同源性为98、13％，与云南牦牛该序列的核苷酸同源性为97．65％，青海牦牛与云南牦牛该基因片段的核苷酸序列同源性为99．45％。