假单胞菌DM11的二氯甲烷脱卤素酶研究──Ⅱ．动力学性质和抑制剂

对来自假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）ＤＭ１１菌株的二氯甲烷脱卤素酶（简称ＤＭ１１脱卤素酶）的动力学性质和抑制剂进行了研究。用１／Ｖ对１／［ｓ］作图法，测出ＤＭ１１脱卤素酶以ＣＨ２Ｃｌ２、ＣＨ２Ｂｒ２、ＣＨ２Ｉ２、ＣｌＣＨ２Ｂｒ和ＣｌＣＨ２Ｉ等５种化合物为底物时的Ｋｍ值分别是６７、２０、５５、７和９μｍｏｌ／Ｌ，比活力分别是７７．８、１２３．３、７８．８、５６．１和６０．３ｍｋａｔ／ｋｇ蛋白。测定了１４种抑制剂对ＤＭ１１脱卤素酶的５０％抑制浓度（Ｉ５０）。甲基谷胱甘肽（ＧＳＣＨ３）是ＤＭ１１脱卤素酶的竞争性抑制剂，四硝基甲烷（ＴＮＭ）是非竞争性抑制剂，当甲基谷胱甘肽和四硝基甲烷与ＤＭ１１脱卤素酶一起保温时，甲基谷胱甘肽对酶有保护作用。     

嗜甲基菌DM11菌株的二氯甲烷脱卤素酶是二聚体蛋白

经ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定,嗜甲基菌ＤＭ１１菌株二氯甲烷脱卤素酶的亚基分子量为３１０００。通过沉降平衡超离心分析和凝胶过滤色谱分析证明,上述脱素酶的天然酶的分子量分别是６５８００和６３５００。这些结果表明,ＤＭ１１菌株的二氯甲烷脱卤素酶是二聚体蛋白。     

谷胱甘肽S—转移酶5—5和细菌二氯甲烷脱卤素酶的性质比较

通过简便的两步阴离子交换色谱，从遗传工程菌株大肠杆菌ＪＭ１０５中纯化出哺乳动物的谷胱甘肽Ｓ－转移酶５－５（ＧＳＴ５－５），ＧＳＴ５－５以二卤甲烷为底物时的动力学常数，热稳定性和最适ｐＨ被测定，并与细菌二氯甲烷脱卤素酶的上述性质进行了比较。     

假单胞菌TS-1138 L-半胱氨酸脱巯基酶的纯化和性质研究

假单胞菌TS-1138L-半胱氨酸脱巯基酶经DEAECellulose-52阶段洗脱、SephadexG-100柱层析被纯化了80.3倍,SDS-PAGE鉴定为单一条带,该酶的相对分子质量为53.0kDa;酶反应的最适pH为7.5,最适反应温度为35℃,该酶的米氏常数为2.37μmol/L,最大反应速度为0.11μmol/mL·min·Pb2+对该酶有很强的激活作用,Zn2+对该酶有较强的抑制作用,羟胺为该酶特异性的抑制剂.     

荧光假单胞菌产木聚糖酶的纯化和性质

有硫酸铵分级沉淀,葡聚糖凝胶分离技术,对荧光假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕ．）所产的半纤维素酶进行分离纯化,得到单一组分的木聚糖酶。通过凝胶电泳法,测得其摩尔式量为３３０００。研究表明,该酶的最适ｐＨ值为６．０,最适温度６０℃。酶的动力学研究测出米氏常数Ｋｍ值为４．７６ｍｇ／ｍｌ。     

类产碱假单胞菌谷氨酸脱氢酶酶学性质的研究

类产碱假单胞菌的谷氨酸脱氢酶水平受氮源调节,以氮为唯一氮源时酶水平有明显提高,研究表明,该酶的最适反应温度为５０℃,催化氢化反应和脱氨反应的最适ｐＨ值分别为８．０和８．８,金属离子及嘌呤核苷酸对酶活力的影响不显著。     

荧光假单胞菌噬铁素的性质研究

本文报道了荧光假单胞菌Ｐ３２产生的噬铁素的特性．噬铁素在紫外光下发出黄绿色荧光，与Ｆｅ３＋有高度亲和性，在２３０ｎｍ和４００ｎｍ附近各有一吸收峰，氨基酸组成为苏氨酸：甘氨酸：赖氨酸：胱氨酸：亮氨酸：天冬氨酸＝２：４：４：４：１：１，生物合成需较低浓度Ｆｅ３＋为条件，与Ｆｅ３＋的复合物无荧光，但可用连二亚硫酸钠，８－羟基喹啉和抗坏血酸粉末恢复荧光．     

假单胞交替菌BYS-2产褐藻胶裂解酶条件研究

以褐藻酸钠作为初筛培养基的唯一碳源,从鲍鱼养殖水样中分离获得一株产褐藻胶裂解酶的假单胞交替菌BYS-2。对该菌株进行产酶条件研究,获得最适产酶配方(w/v)为：褐藻酸钠0.1%,葡萄糖0.05%,酵母膏1%,黄豆饼粉0.3%,(NH4)2HPO4 0.3%,初始培养基pH8.0;最佳产酶条件为：接种量2%(v/v),装液量50mL/250mL,发酵温度20℃,摇床转速200 r/min,在此条件下发酵24h酶活力可达5.29U/mL,比优化前(1.57 U/mL)提高2.37倍。     

交替假单胞菌BYS-2产褐藻胶裂解酶条件研究

以褐藻酸钠作为褐藻胶裂解酶产生菌初筛培养基唯一碳源,从鲍鱼养殖水样中分离获得一株产褐藻胶裂解酶的微生物,形态学和分子生物学16S rDNA鉴定结果显示,该菌株为交替假单胞菌Pseudoalteromonas sp.BYS-2.对该菌株进行产酶条件研究,获得最适产酶配方为:褐藻酸钠1 g·L~(-1),葡萄糖0.5 g·L~(-1),酵母膏10g·L~(-1),黄豆饼粉3 g·L~(-1),(NH_4)_2HPO_4 3 g·L~(-1),初始培养基pH8.0;最佳产酶条件为:接种量2%(体积分数),装液量50 m L/250 m L,发酵温度20℃,摇床转速200 r·min~(-1),在此条件下发酵24 h酶活力可达5.29 U·m L~(-1),比优化前(1.57 U·m L~(-1))提高2.37倍.     

假单胞菌593多铜氧化酶CopA的漆酶活性研究

从假单胞菌593中克隆出多铜氧化酶copA基因,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3) p Lys S过量表达和纯化.纯化的CopA蛋白展示出漆酶活性,针对漆酶的3种底物ABTS、DMP、SGZ,CopA的最适反应pH分别是3. 5、7. 5和7. 5,最适反应温度分别是50℃、50℃和42℃.pH稳定性和热稳定研究发现,在pH 7. 0条件下,CopA比较稳定,在温度大于42℃保存该蛋白,其活性降低较快.二价金属离子影响实验发现,CopA漆酶活性能被二价铜离子显著加强.酶动力学常数实验结果展示,CopA作用于底物ABTS,K_m为0. 281 mmol/L,V_(max)为3. 02×10~(-3)mmol·L~(-1)·min~(-1),k_(cat)为1. 8 s~(-1); CopA作用于底物DMP,K_m为0. 141 mmol/L,V_(max)为4. 54×10~(-3)mmol·L~(-1)·min~(-1),k_(cat)为2. 2 s~(-1); CopA作用于底物SGZ,K_m为0. 025 mmol/L,V_(max)等于0. 7×10~(-3)mmol·L~(-1)·min~(-1),k_(cat)为0. 87 s~(-1).     

固定化恶臭假单胞菌细胞生产丙烯酰胺的研究

本文以海藻酸钙包埋法制备固定化恶臭假单胞菌细胞,以分批反应、间歇反应及连续柱式反应转化0.3mol/l 丙烯晴溶液来生产丙烯酰胺.丙烯晴溶液用0.05mol/l tris—HCl 缓冲液调至pH 值8.0,控制温度为5℃.间歇反应在恒温水浴摇床上以100r/min 振荡进行,13h 后丙烯酰胺浓度积累为30%,丙烯晴的转化率在95%以上.连柱柱式反应在带夹套的串联柱式反应器中进行,以每克湿固定化细胞每小时1 ml 的流速输入底物溶液,可有95%以上的丙烯晴被转化.酶柱实测半衰期达1200 h 以上.反应产物经分离提取后得到白色针状晶体,经红外光谱等鉴定,确认它为丙烯酰胺.     

红假单胞菌的分离鉴定与生长特性

由青岛沿岸潮间带表层沉积物分离出４株光合细菌，经鉴定属于荚膜红假单胞菌和球形红假单胞菌。光照厌氧培养生长实验表明ＨＤ３的最适盐度为Ｓ＝１５－２５，ＰＳ２－２为一淡水菌株。菌株ＨＤ３的最适ＰＨ范围为６．３５－８．３。ＨＤ３、ＲＳ均不能利用硫化物且其生长受较高浓度的硫化物抑制。     

产碱假单胞菌碱性脂肪酶的克隆表达及酶学性质

【目的】为获得可应用于酯类水解及合成的脂肪酶资源,本研究通过筛选分离得到能够水解长链脂肪酸酯的脂肪酶产生菌,克隆表达其脂肪酶基因并研究脂肪酶的酶学性质。【方法】从环境中筛选分离出可水解三硬脂酸甘油酯的菌株,利用16SrDNA对其进行分子鉴定,并扩增其脂肪酶基因和脂肪酶分子伴侣基因。以pET-22b(+)为表达载体,构建共表达重组质粒,转化Escherichia coli BL21(DE3)进行异源表达,并对重组酶进行酶学性质研究。【结果】经16SrDNA鉴定该菌株为产碱假单胞菌Pseudomonas alcaligenes。通过PCR成功克隆到该菌的脂肪酶基因(lipPA-9A)和脂肪酶分子伴侣基因(lipPA-9B),并构建共表达重组质粒pET22b-lipPA-9A-9B,实现脂肪酶LIP-9A的活性表达。酶学性质研究表明LIP-9A的最适反应温度为35℃,最适反应pH值为10.5,最适反应底物为对硝基苯酚辛酸酯(pNPO);同时,LIP-9A还可以催化醇和羧酸发生酯化反应产生酯类物质。【结论】LIP-9A在碱性条件下具有较高活力,且可以催化酯化反应,在洗涤行业和酯合成领域具有一定的应用价值。     

脱氮假单胞菌发酵生产维生素B12高产菌株的选育

以维生素B12生产菌株脱氮假单胞菌05-04为出发菌株,采用紫外线和5-澳尿嘧啶复合诱变处理,选育到一株抗5-澳尿嘧啶突变株5-BU-3-5,该菌株经摇瓶发酵,发酵单位较出发菌株提高了18.0%.该菌株特性优良,经57m3发酵罐试验,平均发酵单位提高8.9%,是一株性状较稳定可深入开发研究的优良菌株.     

寡聚核糖核苷酸降解酶影响铜绿假单胞菌的能量代谢

铜绿假单胞菌是一种自然界中广泛存在的革兰氏阴性条件致病菌.在该菌的RNA代谢过程中,存在一种以NanoRNA(2-5nt的寡聚核糖核苷酸)为底物的寡聚核糖核苷酸降解酶(Oligoribonuclease, Orn).在本研究中,发现铜绿假单胞菌orn突变菌株的生长速度变慢,因此使用ATP,NADH检测试剂盒,利用酶标检测法和流式细胞分析研究Orn对细菌生理状态的影响.研究结果表明,铜绿假单胞菌orn基因的缺陷可以导致细菌胞内NADH和细菌细胞膜电位差的降低.这进一步导致细菌胞内ATP合成的降低,从而影响细菌的能量代谢.     

荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens GcM5 1A菌株的胞外木素过氧化物酶的部分纯化和鉴定

荧光假单胞菌GcM5 1A是松材线虫携带的一种致病菌。在GcM5 1A的培养液中发现有木质素过氧化物酶的活性,同时显示很强的毒性。通过对其胞外木质素过氧化物酶的酶学性质的初步研究发现：其最适温度为35 ℃,最适pH为4.0。在15~35 ℃、pH为6.0~9.0范围内,酶活保持相对稳定。NH2OH·HCl和KCN对酶活的抑制作用分别达到88 %和57 %,而NaN3对酶活的抑制作用只有15 %左右。Ca2+、Mn2+ 和Fe3+对其活性有增强作用,但是Hg2+ 和 Zn2+却有中等的抑制作用。KCN 和NH2OH·HCl抑制其酶活性分别达57 %、88 %,而NaN3的抑制率仅为15 %。吸收光谱显示该酶在406 nm处有一个Soret峰,加入1 mmol/L Na2S2O4后,吸光度出现了明显的下降,但Soret峰没有显著移动。     

荧光假单胞菌P32培养基的优选

本文对荧光假单胞菌P32的培养基成分进行了研究,利用正交试验筛选出产菌量较高的培养基,成分如下:(％,W/V)蔗糖6,甘油3,蛋白胨1,NH_4H_2PO_4,0.5.