人白血病抑制因子基因在酵母中的融合表达

用PCR突变的方法使人白血病抑制因子基因的终止密码子缺失,并与质粒pPICZαA上的myc表位及6个组氨酸处于同一读码框,构建融合表达载体pPICZαA-hLIF^M。通过氯化锂化学转化法使表达载体整合到毕赤巴斯德酵母X－33的基因组DNA中,转化子经甘油增菌和甲醇诱导,实现了hLIF基因在毕赤酵母表达载体系统中的表达。SDS－PAGE检测和Western blot分析结果表明在相对分子质量为61000处有一条人白血病抑制因子特异蛋白带。凝胶薄层扫描分析结果显示表达的目的蛋白占培养液上清总蛋白的33．3％。且该表达产物具有抑制小鼠畸胎瘤细胞F9克隆形成的活性。     

人血管内皮抑制素基因在毕赤甲醇酵母中的表达

对发生突变的人血管内皮抑制素基因进行了PCR修正,并将其连接到pAO815载体上,然后克隆进大肠杆菌TOP10F＇中,提取质粒测序,证实序列正确.再用电激法转化毕赤甲醇酵母KM71,利用RDB平板和PCR技术筛选出阳性克隆菌落后,甲醇诱导表达,SDS-PAGE电泳检测显示重组的人血管内皮抑制素蛋自在毕赤甲醇酵母KM71中获得了有效表达.     

人胰激肽原酶在毕赤酵母中的分泌表达

人胰激肽原酶(hPK)编码基因由本实验室设计、合成,并重组构建成表达质粒pPIC9k-hPK。经电穿孔将该质粒转化毕赤酵母GS115 (His^-Mut⁺) ,筛选His⁺Mut^s 型高拷贝菌株,摇瓶诱导表达重组hPK。经SDS-PAGE凝胶电泳分析确定表达重组蛋白相对分子质量为37500,产量达40mg/L,质量分数占总蛋白的30%以上。初步浓缩的重组hPK经测定具有酶活性,表明其在毕赤酵母中得到了正确的表达,每mL酶活达0.717nmol/s。     

Monellin基因在酵母中的表达研究

本实验根据毕赤酵母偏爱密码子,人工合成了高甜度monellin基因,并构建了重组分泌型酵母表达载体pPIC9KM,通过电击转化获得了可高效分泌表达有甜味活性高甜度monellin的重组毕赤酵母GS115/pPIC9M.通过PCR检测证实monellin基因已经整合进酵母基因组,SDS-PAGE和Westerm blot免疫杂交知所表达的蛋白是目的蛋白,最后通过双盲测定证实表达的蛋白比同等重量的蔗糖甜约1000倍.     

酵母Elp3在毕赤酵母中的分泌表达及活性测定

酵母Elp3是Elongator复合物的催化亚基,可参与组蛋白乙酰化修饰与基因转录延伸.生物信息学分析及有关研究表明Elp3除组蛋白乙酰转移酶(Histone acetyltranferase,HAT)活性外,可能还拥有组蛋白去甲基化酶活性.本文以yElp3的pYES2yElp3质粒为模板,PCR获得yElp3基因全长,插入改造过的毕赤酵母表达载体pPIC9KH,转化巴斯德毕赤酵母GS115菌株.经表型鉴定、PCR分析及G418筛选获Mut+型多拷贝整合菌,经0.5%的甲醇诱导和Ni-NTA纯化,得到目的蛋白并对其进行体外酶活测定.SDS-PAGE分析表明yElp3在毕赤酵母中实现了高效分泌表达,Western印迹证实得到的蛋白为yElp3.OPA法测得纯化蛋白拥有较好的HAT活性,具有生物活性的Elp3蛋白的获得为体外测定其第二结构域是否有催化活性奠定了基础.     

人源EC-SOD在毕赤酵母中的构建与表达

利用基因工程技术构建表达载体并电转化至毕赤酵母中,成功实现人源EC-SOD在毕赤酵母X33中的表达.重组蛋白经盐酸羟胺法测得25 mL摇瓶发酵液上清酶活为508 U·mg~(-1),5 L发酵液上清酶活为909U·mg~(-1).发酵液上清用硫酸铵沉降后,使用DEAE弱阴离子交换树脂初步分离纯化出较纯的EC-SOD,测得比活为1 700 U·mg~(-1),并进行氯化硝基四氮唑蓝(NBT)活性定性染色.结果表明,毕赤酵母成功胞外表达具有一定活性的SOD蛋白.     

人Elp3在毕赤酵母中的分泌表达及HAT活性测定

人Elp3蛋白(human Elongator protein 3,hElp3)是组蛋白乙酰转移酶(Histone acetyltranferase,HAT)Elongator复合物的催化亚基,可参与组蛋白乙酰化修饰与基因转录延伸,其功能异常与人类多种疾病相关.目前对其羧基末端高度保守的第二功能域研究较少.以pYES2hElp3质粒为模板,PCR获hElp3基因全长,插入改造的毕赤酵母表达载体pPIC9KH,转化巴斯德毕赤酵母菌GS115菌株.经表型鉴定、PCR分析和G418筛选得到Mut+型多拷贝整合菌.0.5%的甲醇诱导hElp3高效分泌表达,Ni-NTA纯化及Western印迹证实获目的蛋白.OPA法测得其拥有良好的HAT活性,为体外测定其第二结构域是否拥有催化活性奠定了基础,对筛选抑制其HAT活性的小分子药物用于疾病治疗研究至关重要.     

产人胰岛素毕赤酵母工程菌的构建

根据人胰岛素的氨基酸序列和酵母偏爱的密码子,采用基因半合成技术合成人胰岛素基因.将合成的胰岛素基因克隆到pP IK 9质粒,构建了毕赤(P ich ia)酵母重组表达载体pP IN S319,用B g lⅡ线性化后用电转化法导入毕赤酵母G S ll5菌株,经过营养筛选和PCR复筛,得到含人胰岛素基因的毕赤酵母工程菌株.经SDS-PAGR和密度扫描分析表明,合成的人胰岛素基因能够在毕赤酵母中高效分泌性表达,表达量可达0.563 m g/mL,表达产物无需转肽过程,只经过胰蛋白酶和羧肽酶B简单处理即得到优质重组人胰岛素,其体内活力约为30 IU/m g.     

血小板生成素在毕赤酵母中的表达

以人胎肝cDNA文库为模板,用PCR和DNA重组技术,将TPOcDNA克隆到pGEM     

重组鸡IL-18与新城疫HN基因融合蛋白在毕赤酵母中表达条件的优化

为探索ChMIL18-HN在毕赤酵母中最适宜的表达条件,采用小型摇瓶培养系统,通过对重组毕赤酵母菌X-33/pPICZαA-ChMIL18-HN在不同诱导时间、培养液pH值、甲醇诱导剂剂量及培养温度的条件下表达目的蛋白的分析,以对其表达条件进行优化。结果表明:重组菌X-33/pPICZαA-ChMIL18-HN在pH6.5,甲醇诱导浓度为1.5%,培养诱导温度为30℃的条件下诱导156h,目的蛋白的表达量最高。     

小鼠子宫内膜LIF基因表达与孕激素的关系研究

白血病抑制因子（LIF）是一种多功能活性的糖蛋白，LIF基因在大多数妊娠第4天的小鼠子宫内膜进行着强烈的表达，然而LIF基因表达调控的机理目前尚不清楚，本实验对130只妊娠4－5d的小鼠LIF基因表达和血清中孕激素水平分别进行了检测，发现12只小鼠（占总数的9．23％）无LIF基因表达，无该基因表达小鼠血清中孕激素水平显著低于其它表达的小鼠。实验结果表明：孕激素可能是LIF基因表达的复杂的调控体系中的一个重要的调控因素。     

转录因子GATA—1基因在白血病中的表达

转录因子ＧＡＴＡ家族在造血细胞的正常发育中起着重要的作用。利用聚合酶链反应方法分析了１１６例各种白血病中红系统特异转录因子ＧＡＴＡ－１的表达情况。ＡＮＬＬ、ＣＭＬ、Ｃ－ＡＬＬ和ＣＬＬ中的表达率分别为４３．７５％、８８．２４％、１４．２９％和３３．３３％；３例Ｔ－ＡＬＬ均不表达该基因。     

人碱性成纤维细胞生长因子在大肠杆菌中的融合表达

将人碱性成纤维细胞生长因子ｈｂＦＧＦ基因克隆于质粒ｐＧＥＸ，构建了融合蛋白ＧＳＴ－ＦＧＦ的表达质粒ｐＧＥＸ－ＦＧＦ，将ｐＧＥＸ－ＦＧＦ转化大肠杆菌ＤＨ５α，诱导培养后测得融合蛋白表达量占菌体总蛋白量的２２％，每升发酵液中可产生１８８ｍｇ ＧＳＴ－ＦＧＦ。     

人骨唾液酸蛋白在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达

以PCR方法扩增人bsp基因，与分泌型表达载体pPICZαA重组，重组质粒经电击转化毕赤酵母GS115菌株，获得的GS115／pPICZαA－hbsp表达菌株能高效分泌表达rhBSP.SDS-PAGE和Western blot分析结果表明，产物的分子质量接近66ku，能发生特异性抗原－抗体反应。     

Cloning and Expression of Recombinant Human Thymosin in Yeast Pichia pastoris

The gene of human thyrnosin alpha 1 (hT(1)was synthesised according to favorite eodons of Pichia pastoris by PCR. N-terminal 28 amino acid residues of 40S ribosomal protein (RP), S24Ethat is N-aeetylserine were replaced by hT( 1 for the constitution of hT(1-RP fusion gene in order to express acetyllated thyrnosin α1. And also, the Asn-Gly bond was designed to faeiliate isolation of the target protein. The fusion gene was cloned into the expression vector, pPIC/gK. The constructs were transformed into HIS4 mutant strain GS115 by eleetroporation. Both SDS-PAGE analysis and Western blot analysis indicated that the fusion protein was expressed successfully.     

兔防御素基因酵母表达的研究

防御素是由动植物体内产生的一种多肽类抗菌、抗病毒活性物质,本研究根据巴斯德毕赤 酵母偏爱密码子的特性,设计兔防御素NP2基因,并构建巴斯德毕赤酵母的表达质粒pGAPZα-NP2,通 过LiCl法转入巴斯德毕赤酵母中,筛选和检测结果表明,兔防御素NP2基因已经成功地转入巴斯德毕 赤酵母,并得到表达。该实验可为兔防御素NP2抗菌抗病毒的研究和开发奠定理论和物质基础。     

内皮细胞抑制素在毕节酵母中的表达与活性分析

采用PCR技术从人胎脑cDNA库中扩增了人内皮细胞抑制素基因。经DNA序列分析后将扩增的基因克隆至酵母载体pPICgK，获得的重组质粒pPIC9K-EDN转化毕节酵母GSll5，构建表达内皮细胞抑制素的酵母工程菌P.pastoris GSll5(pPIC9K-EDN)。SDS-PAGE分析结果显示：人内皮细胞抑制素在重组酵母GSll5(pPIC9K-EDN)中获得高效表达。用30L发酵罐构对建的工程菌进行高密度发酵，经甲醇诱导48h，生物量达到250OD，分泌量为150mg/L，发酵液经SP Streamline，SP Sepharose FF阳离子交换柱和SephamseHeparin Hi Trap柱纯化，产物纯度达到98％。纯化产物具有免疫活性并能抑制bFGF诱导的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成。     

非妊娠小鼠子宫内膜白血病抑制因子基因表达研究

白血病抑制因子（LIF）能抑制胚胎干细胞的分化和保持其增殖能力,并与胚泡着床及胚胎早期发育有着密切的关系。经实验证实,LIF基因在子宫内膜中的表达具有高度的时间限制性。采用反转录聚合酶链式反应技术（RT－RCR）对小鼠子宫内膜LIF基因表达进行了研究,结果显示：妊娠第4天小鼠的子宫内膜组织的样本在电泳图的538bp处出现清晰的电泳带,表明该组织有LIF基因的强表达;而在所检测的13只非妊娠小鼠子宫内膜的组织样本中均未发现LIF基因表达讨论了小鼠动情周期中各阶段的孕激素水平对子宫内膜LIF基因表达产生的影响,提出了一定的孕激素水平是启动LIF基因表达的必要条件     

融合表面抗原SA—28基因在Pichia pastoris酵母系统中的表达

将乙肝病毒表面抗原Ｓ－ｐｒｅＳ１融合基因ＳＡ－２８插入质粒载体ｐＡＯ８１５的ＥｃｏＲ Ｉ位点中,将其置于Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ 酵母ＡＯＸ１启动子控制下,利用电转化技术,融合基因表达单元链同ＨＩＳ４基因被整合到受体菌ＳＭＤ１１６８基因组中。对得到的工程菌进行发酵和表达产物的研究表明：ＳＡ－２８基因在该系统中的表达受甲醇诱导调控;ＳＡ－２８融合基因的表达产物具有Ｓ和ＰｒｅＳ１的双重抗原性。用