一步法免疫亲和层析纯化重组人肿瘤坏死因子

提出一种简便的免疫亲和层析方法，有效地分离纯化重组人肿瘤坏死因子（ｒＨＴＮＦ），此法不需预先分离纯化单克隆抗体．用交联刘ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｂｅｒｉｍｉｄａｔｅ使抗ＴＮＦ的单克隆重抗体和ｐｒｏｔｅｉｎＡ—ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－４Ｂ共价结合，成为稳定的免疫基质，制备免疫亲和层析柱，将重组ＴＮＦ粗制品一步纯化为均一组份．     

重组人肿瘤坏死因子粗提取工艺的研究

通过研究重组人肿瘤坏死因子α(rhTNF-α)的粗提取工艺中各操作条件对目标蛋白纯化的影响,发展了一条纯化rhTNF-α的集成化工艺.该工艺组合细胞破碎,热变性与硫酸铵分级沉淀,有效节省离心步骤,缩短工艺流程,所得粗提物中目标蛋白占总蛋白含量的57%,目标蛋白回收率为90.3%,活性回收率为85.8%,各项指标均比未集成的工艺有较大程度的提高.     

柱层析法纯化重组人肿瘤坏死因子α及其抑癌作用

半合成人肿瘤坏死因子ＴＮＦ－α在大肠杆菌中高表达．发酵后收集菌体经超声破碎，然后在１２０００ｒ／ｍｉｎ４℃离心１０ｍｉｎ，上清经６０℃热处理３０ｍｉｎ，离心上清用６０％饱和度的硫酸铰沉淀，再依次经过ＳｅｐｈａｄｅｘＧ—２５、ＤＥＡＥ—５２纤维素和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ—７５柱层析，得到的纯化ｒｈＴＮＦ—α比活性为２×１０７ｕ／ｍｇ，回收率为２４％．经过ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳和ＨＰＬＣ鉴定，纯度达９５％左右，分子量为１７×１０３．ｒｈＴＮ—α对热稳定性试验表明，—２０℃下贮存一年或者０℃下贮存一个月，ｒｈＴＮＦ—α活性仍保留５０％．人胃癌和肝癌细胞株的体外抑瘤试验和接种小鼠的活体抑瘤试验表明，本实验取得的ｒｈＴＮＦ—α具有明显的抑瘤生长作用．     

肿瘤坏死因子与临床检测

肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)最早是从巨噬细胞中发现的仅杀伤癌细胞而不损伤正常细胞的因子,它能激活中性粒细胞并刺激其产生超氧化物,释放溶酶体酶,从而提高杀灭微生物的活性.TNF水平测定对于某些疾病的诊断、判断预后及指导用药均具有重要意义.本文就这几方面国内外研究近况综述如下:一、TNF来源、特点、生理作用TNF-α最早由Carswell等于1975年首先报道的,1984年Penica等分离表达了人的TNF-α的cDNA.目前,人们根据TNT的来源暂分为三种:一是由活化的单核或巨噬细胞分泌产生的称为TNF-α;二是由活化的T-淋巴细胞分泌产生的称为TNF-β;三是由NK细胞分泌产生的称为TNF-γ.人TNF-α是由3个分子量为17KD的单体通过1个二硫键非共价组成的,含有157个氨基酸的非糖蛋白;人TNF-β则是由171个氨基酸组成的、分子量为25KD的糖蛋白,分子内无半胱氨酸.TNF的生物学效应是:适量的TNF可调节机体的免疫及代谢功能,增强机体对入侵病原体的抵抗力,对维持机体内部的稳定状态及抵制各种致病因子的侵袭具有重要意义.但是,TNF的过量表达则与机体的炎症、感染、机体损伤等病理状态有关.TNF-α诱导的各种细胞反应是通过与细胞表面两类特异性受体相互作用而产生的,即55KD的TNF受体(TNF receptor,TNF R_1)和75KD     

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白生物仿制药对大鼠类风湿性关节炎的治疗作用

目的:评价重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(TNFR-Fc)生物仿制药对大鼠佐剂性关节炎的治疗作用.方法:将大鼠随机分成6组:阴性对照组(生理盐水)、阳性药物组(Enbrel)和TNFR-Fc高、中、低质量分数组,空白组(无炎症),每组6只,弗氏完全佐剂(CFA)建立类风湿性关节炎模型.给药13 d后,分别测量大鼠体重、后足足垫厚度,关节炎指数评分,ELISA法测量细胞因子水平.结果:与阴性对照组相比,Enbrel组和TNFR-Fc大、中、小质量分数组的大鼠体质量明显增加(P0.05)、继发性足肿胀减弱(P0.05)、关节炎评分分值、IL-1β、TNF-α、IL-6含量均减小(P0.05),IL-10含量升高(P0.05).结论:TNFR-Fc通过降低炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平以及升高IL-10水平来发挥治疗类风湿性关节炎的作用.     

肿瘤坏死因子的来源及生物学功能简介

本文主要阐述了肿瘤坏死因子的来源及定位,以及在肿瘤的发生、一些重要疾病的发生过程以及卵巢发育过程中的生物学功能。     

柱层析法纯化且人肿瘤坏死因子α及其抑瘤作用

半合成人肿瘤坏死因子ＴＮＦ－α在大肠杆菌中高表达，发酵后收集菌体经超声破碎，然后在１２０００ｒ／ｍｉｎ４℃离心１０ｍｉｎ，上清经６０℃热处理３０ｍｉｎ，离心上清用６０％饱和度的硫酸铵沉淀，再依次经过ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２５，ＤＥＡＥ－５２纤维素和Ｓｅｐｈａｄｅｘ－Ｇ－７５柱层析，得到的纯化ｒｈＴＮｆ－ａ比活性为２×１０＾７ｕ／ｍｇ，回收率为２４％，经过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳和ＨＰＬＣ鉴定，纯度达９５     

人新型肿瘤坏死因子在E.coli中的高效表达、纯化及诱导凋亡活性

采用PCR技术获得了新型的人肿瘤坏死因子基因，在153位氨基酸处引入突变，使Gly突变为Leu.将突变体hTNF基因克隆到表达载体pQE30中，SDS-PAGE结果显示经IPTG诱导后,hTNF基因获得大量表达，通过Ni金属螯合层析柱亲和层析获得到纯化的hTNF融合蛋白，Western blot结果表明hTNF蛋白可与抗TNF的抗血清知识性发生特异性反应，荧光染色实验检测了hTNF蛋白诱导细胞发生凋亡的活性。     

重组人源性抗HBsAg Fab抗体的特性分析

通过噬菌体展示技术从含高滴度抗乙肝表面抗原(HBsAg)抗体的人外周血淋巴细胞获得抗HBsAg Fab抗体的轻、重链基因．将Fab的轻、重链基因分别整合到巴斯德毕赤酵母(Pichua pastons)GS115菌株的染色体上,成功构建了高效分泌表达抗HBsAg Fab抗体的酵母工程菌．对酵母表达的重组Fab抗体进行了纯化,并对其相对分子质量、糖基化以及抗原结合能力等特性进行了分析,结果显示重组酵母分泌表达的重组人源性抗HBsAg Fab是一个相对分子质量为50000左右的低糖基化糖蛋白,1mg重组Fab抗体相当于40u的抗乙肝表面抗原抗体(20U／mg)．表明重组Fab抗体具有较强的结合HBsAg的能力．     

重组人碱性成纤维细胞生长因子的纯化及生物活性鉴定

目的 :探讨重组人碱性成纤维细胞生长因子 (rhbFGF)的纯化工艺和活性鉴定 .方法 :将rhbFGF工程菌大量扩增后通过包涵体提取、复性、阳离子交换、凝胶过滤等技术进行纯化 .结果 :纯化后的rhbFGF ,相对分子质量为 17× 10 3,蛋白纯度为 95 %以上 ,比活为 1 7× 10 6 U/mg ,对NIH3T3细胞具有明显的促分裂活性 .结论 :通过复性和两步层析的纯化方法可获得高纯度、高回收率和高生物活性的rhbFGF ,可用于实验室研究及临床试验     

大豆凝集素的分离纯化及活性鉴定

以D-半乳糖胺为配基、 FF-sepharose 4B为固定相, 制备大豆凝集素亲和层析填料. 分离和纯化大豆中的大豆凝集素蛋白, 测定其纯度、 免疫原性和凝集活性, 并与美国Sigma公司的标准品比较. 结果表明： 每毫升GalN-FF-Sepharose-4B层析填料能结合10 mg大豆凝集素; 纯化获得的大豆凝集素分子量为30 000; SDS-PAGE测定纯度大于98%; Western blot结果为阳性; 1 mg/mL SBA血集效价为1/2^10; 其纯度、 免疫原性和凝集活性等指标与大豆凝集素标准品相同, 与理论值相符.     

人类TBC1D7蛋白的表达纯化及其在mTOR通路中的作用机制研究

mTOR信号通路在真核细胞代谢调控中发挥着关键的调控作用,该通路核心元件mTORC1复合物的活性受其上游TSC复合物负调控,TSC复合物包括TSC1、TSC2、TBC1D7三种蛋白.以TBC1D7蛋白为研究对象,通过氨基酸序列比对显示多物种来源的TBC1D7蛋白具有较高的保守性,且蛋白三维结构分析证实其分子表面存在高度保守区域.随后,构建了人类TBC1D7蛋白原核表达载体并在大肠杆菌中表达得到全长TBC1D7蛋白,经过酶切去除标签和凝胶排阻层析得到了高纯度TBC1D7蛋白.另一方面,通过在HCM细胞中对TBC1D7进行敲降和过表达,证实了TBC1D7的表达会直接升高mTORC1的活性;反之,升高TBC1D7的表达则会抑制mTORC1的活性.本研究表达和纯化了人类TBC1D7蛋白,并探讨了在人类心肌细胞中TBC1D7的表达与其下游mTOR信号通路之间的联系,为人类TBC1D7蛋白和mTOR信号通路的进一步研究打下了良好基础.     

固定化金属螯合亲和膜制备及其性能研究

将纤维素滤纸经碱处理,环氧活化,配基偶联和固定化Cu2 后制得了大 孔纤维素亲和膜,检验了亲和膜的流速与负压,等温吸附,保存方法及使用次数等亲和膜性能指标,设计了一种解决金属离子泄漏问题的新方法,得到的结果明显优于传统的凝胶柱,以上结果表明,普通纤维素滤纸可以制成性能优良的亲和膜色谱介质。     

玉米Mn-SOD的分离纯化与性质分析

利用金属螯合亲和层析,结合DEAE-纤维素离子交换层析,从玉米匀浆液中分离纯化到电泳纯的Mn-SOD组分.双向电泳和SDS-PAGE分析表明:玉米Mn-SOD的亚基分子质量为26.2 kD,等电点为5.3;热稳定性、酸碱稳定性高于玉米Cu/Zn-SOD.     

重组纳豆激酶的分离纯化及酶学性质的初步研究

将已构建好的表达载体pTYB102转化大肠杆菌,经IPTG诱导,表达出以可溶形式存在的有活性的纳豆激酶．首先对表达条件进行优化,最佳诱导温度是15℃,最佳诱导时间是10h．然后将离心收集到的菌体通过超声波破碎、硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-100柱层析以及冷冻干燥等步骤进行分离纯化,得到电泳纯的有溶栓活性的纳豆激酶．冷冻干燥品在SDS—PAGE上呈一条蛋白质带．纯化倍数35倍,纯酶比活1147．54．该酶的最适反应条件是45℃,pH8．0．酶活性在pH6．0～11．0,55℃以下稳定．     

重组Hepcidin融合蛋白的金属螯合亲和层析纯化

在大肠杆菌中表达的重组Hepcidin融合蛋白以包涵体形式存在,其N端带有6个组氨酸。以Ni²⁺-IDA-Sepharose Fast Flow为层析介质,在变性条件下以不同的咪唑和pH值洗脱方式对Hepcidin融合蛋白的纯化效果进行了比较,确定了该融合蛋白的金属螯合层析纯化条件。以60mmol/L咪唑洗脱杂蛋白,然后将pH值降至4.0洗脱融合蛋白,纯化后的融合蛋白纯度大于95%,而且不含咪唑,有利于下一步Hepcidin的制备。金属螯合层析中融合蛋白收率不低于90%。Ni²⁺-IDA-Sepharose Fast Flow对该融合蛋白的吸附量为30.4mg /mL。     

4种促性腺激素释放激素抗体的制备、鉴定和纯化

用3-马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯(MBS)法将人工合成的4种不同来源的促性腺激素释放激(GnRH)(即章鱼GnRH、海鞘GnRH-Ⅰ、七鳃鳗GnRH-Ⅰ和七鳃鳗GnRH-Ⅲ)分别与匙孔戚血蓝蛋白(KLH)偶联后作为抗原,免疫新西兰大白兔获得GnRH抗体.用间接ELISA方法检测抗血清效价,并用Western blot鉴定其特异性.制备抗原肽亲和纯化柱,纯化多克隆抗体.结果显示,4种多克隆抗体效价高达1∶500 000(体积比),并能和相应的GnRH多肽特异性结合,纯化后的抗体在SDS-PAGE显示为单一条带.通过上述方法,获得4种高效价、高纯度的GnRH抗体,为低等动物GnRH的研究提供了理论依据.