抗促黄体激素单克隆抗体的研制 Ⅰ杂交瘤细胞株的建立

用促黄体激素(LH)为抗原免疫BALB/C小鼠,通过免疫小鼠脾细胞和SP_2/0小鼠骨髓瘤细胞的融合,产生分泌抗LH单克隆抗体(McAbs)的杂交瘤细胞。用ELISA法检测融合细胞培养上清,从195份检样中测出两份能与LH抗原起反应。对该2孔杂交瘤细胞进行亚克隆和扩大培养。经体外四个月传代培养及液氮冻存后复苏培养。仍保持分泌抗LH的McAbs的能力,所建立的二株杂交瘤细胞命名为AL—01和AL—02。给予注液体石蜡的BALB/C小鼠注入该二种细胞,均能诱生腹水。用ELISA法测腹水抗体,效价分别为10~(-6)以上和10~(-5)以上。通过染色体组型分析,确认AL—01和AL—02皆为杂交瘤细胞。     

抗甲胎蛋白单克隆抗体的研制及其在免疫组化中的应用

以高纯AFP为抗原,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞和小鼠SP2/0 Ag14骨髓瘤细胞融 合,经2次亚克隆,建立5株稳定分泌抗AFP特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。应用经纯化 的该单克隆抗体进行了原发性肝癌组织切片的免疫组织化学实验,结果显示全部5种抗AFP单 克隆抗体对肝癌亚细胞组分均呈现特异性结合。表明已筛选出适于制作甲胎蛋白临床诊断试 剂盒所需的特异性单克隆抗体。     

抗人癌胚抗原单克隆抗体的研制及其在免疫组化中的应用

以高纯CEA为抗原,免疫BALB／c小鼠．取其脾细胞和小鼠SP2／0-Ag14骨髓瘤细胞融合．经2次亚克隆。建立3株稳定分泌抗CEA特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。应用经纯化的该单克隆抗体进行了结肠癌组织切片的免疫组织化学实验．结果显示全部3种抗CEA单克隆抗体对结肠癌亚细胞组分均呈现特异性结合。表明已筛选出适于制作癌胚抗原临床诊断试剂盒所需的特异性单克隆抗体。     

抗传染性支气管炎病毒M蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

将传染性支气管炎病毒M41毒株通过接种鸡胚的方法扩繁,从含病毒的尿囊液中提取总RNA,RT-PCR扩增M基因,构建原核表达载体pGEX-6p-1-M,导入大肠杆菌Transetta (DE3)内诱导表达。将纯化后的重组M蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术制备能稳定分泌抗M蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。通过小鼠体内诱生腹水的方法大量制备抗M蛋白的单克隆抗体,用辛酸/硫酸铵方法纯化腹水,并对纯化的单克隆抗体进行了鉴定。     

单克隆抗体亲和渗滤法制备两种牛生殖激素

在本室已获得高特异抗牛促卵泡激素 (bFSH)和抗牛促黄体激素 (bLH)杂交瘤细胞的基础上 ,制备纯化抗bFSH和抗bLH两种单克隆抗体 (McAbs) ,并进而建立了一种单抗免疫亲和渗滤新技术。使用该技术成功地制备了上述两种牛生殖激素 ,从 7g牛垂体干粉可提取 3.3mg亲和纯bFSH和 1 1 .1mg亲和纯bLH。回收率分别为 85 %和 82 %。     

脊髓灰质炎病毒I型单克隆抗体的制备

目的: 为建立脊灰病毒Sabin株I型特异的单克隆抗体．方法:以Vero细胞增殖病毒并用蔗糖密度梯度离心法纯化后,用病毒免疫SPF级Balb/c小鼠．取小鼠免疫脾淋巴细胞与SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞进行细胞融合,通过间接 ELISA 法筛选抗体阳性的杂交瘤细胞,并用有限稀释法克隆化．用细胞培养法制备脊灰病毒单抗,并以中和试验测定单抗效价．结果:获得了8株分泌抗脊灰病毒Sabin株I型单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中1株G8G7能够稳定分泌抗体．间接ELISA 法测得单抗的效价为1∶8,中和试验测得中和抗体的效价为1∶58．结论:G8G7分泌的抗体为抗脊灰病毒Sabin株I型特异的单克隆抗体.     

抗促黄体激素单克隆抗体的研制：Ⅱ单克隆抗体的纯化及特性鉴定

在建立六株稳定分泌抗促黄体激素(LH)单克隆抗体的杂交瘤细胞株后,用羟基磷灰石(HAP)吸附层折技术从小鼠特异腹水中一步纯化抗LH单克隆抗体,抗体纯度可达85％—90％,在纯化抗体的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)图谱上基本显示IgG一条带,每ml腹水回收IgG量为3.6mg,并保留大部分抗体活性。特性鉴定结果表明,在六种抗体LH单克隆抗体中,AL-02和AL-06两种抗体与促卵泡激素(FSH)不产生交叉反应,是抗LH-β亚单位上的抗原决定簇的:其它四种抗体与FSH产生完全的交叉反应,是抗LH-α亚单位上抗原决定簇的。用測定抗体与抗原相对结合力的方法估算了四种抗LH单克隆抗体的相对亲和力,结果是AL-01抗体相对亲和力提高,其后依次是AL-03,AL-04和AL-02抗体。     

抗KDR-Fc杂交瘤细胞系的建立

用杂交瘤技术建立抗KDRFc的杂交瘤细胞系,以KDRFc抗原免疫雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经ELISA间接法检测和有限稀释法克隆培养,再经稳定性检测、效价检测,筛选出分泌抗KDRFc单克隆抗体的杂交瘤细胞.得到了10株能持续分泌抗KDRFc的单克隆抗体的细胞株,其中3株分泌的单抗具有较高的生物活性、特异性和稳定性.     

抗人体乳腺癌单克隆抗体6C_6杂交瘤细胞株的建立

用乳腺癌患者的原发瘤组织制备的细胞膜抗原免疫BALB/C小鼠,取致敏脾脏细胞与SP_(2/0)骨髓瘤细胞融合。融合率为42％,经克隆化培养后得到一株分泌抗人体乳腺癌单克隆抗体杂交瘤细胞,命名为6C_6。其分泌的抗体和乳腺癌细胞系MCF-7呈阳性反应,与其它5种人癌细胞系,1种人正常细胞系及4种鼠类肿瘤细胞系呈阴性反应。免疫组织化学实验表明:6C_6单克隆抗体(简称6C_6McAb)与乳腺癌的反应多呈阳性(30/36),与7例正常乳腺均呈阴性反应。6C_6McAb类别为IgC_1。其抗体经ZetaPrep大容量离子交换圆盘纯化,对乳腺癌原发瘤组织仍具有较高的活性。     

抗Der p 2单克隆抗体细胞株的建立与鉴定

目的:建立Der p 2(屋尘螨Ⅱ类变应原)杂交瘤细胞株,并对其分泌的Der p 2单克隆抗体进行鉴定.方法:用重组Der p 2蛋白作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选和3次克隆化,制备出单克隆抗体.采用间接ELISA法、Western blot法确定单克隆抗体的免疫球蛋白的类型和亚类、相对亲和力、特异性,对单克隆抗体进行鉴定.结果:获得3株能稳定分泌高效价Der p 2单克隆抗体的杂交瘤细胞株,1B6为IgG1类,1G11、4B1为IgG2a类.间接ELISA法检测细胞上清效价为104~105,腹水效价为105~106.Westernblot试验证明3株单抗与Der p 2蛋白均有特异性反应.结论:成功制备了3株抗Der p 2的单克隆抗体,均具有良好的特异性和亲和力,为进一步建立Der p 2蛋白检测和纯化的方法奠定了基础.     

抗棉铃虫组织蛋白酶B单克隆抗体的制备及鉴定

分别以棉铃虫组织表达的组织蛋白酶B和基因重组的大肠杆菌表达的组织蛋白酶B为抗原免疫BALB／c小鼠，选择血清抗体滴度高的免疫小鼠，取其脾细胞和Sp2／0骨髓瘤细胞进行细胞融合．经ELISA法筛选阳性克隆和有限稀释法克隆细胞，共获得分泌抗组织蛋白酶B的单克隆抗体杂交瘤细胞3株，分别命名为9D5，100E2和100H6．以ELISA法和Western blotting法对3株杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体进行了特异性鉴定，其中9D5和100E2能够同时识别两种不同来源的组织蛋白酶B，而100H6只能识别基因重组的大肠杆菌表达的组织蛋白酶B．     

乙型脑炎病毒(JEV)单克隆抗体的制备及初步应用

目的制备乙型脑炎病毒(JEV)单克隆抗体,应用于猪源性生物制品中JEV的检测。方法提纯病毒抗原,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA方法筛选和有限稀释法三次克隆获得4株杂交瘤细胞,并应用琼脂扩散、酶联免疫吸附试验和免疫荧光方法进行抗体鉴定和样品检测。结果获得4株稳定分泌JEV单克隆抗体的杂交瘤细胞株G10、F4、C10、A5,免疫荧光抗体实验证实是特异的抗JEV抗体,其免疫球蛋白亚类G10和F4为IgG1,A5为IgM,C10未鉴定出其亚类。G10和F4腹水效价为105以上,C10和A5腹水效价为102以上。结论成功制备了抗JEV单克隆抗体,建立了以单抗介导的间接ELISA和间接IFA检测方法,并应用于猪源性生物制品中JEV的检测。     

尼罗罗非鱼IgM单抗的制备及IgM+B淋巴细胞吞噬能力的研究

采用免疫亲和层析方法纯化尼罗罗非鱼抗TNP特异性IgM，并以此为抗原免疫Babl/c小鼠进行单克隆抗体制备. 免疫的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合成杂交瘤细胞，利用酶联免疫吸附法、蛋白质印迹法(Western blot)和流式细胞术筛选获得两株抗IgM重链的单克隆抗体，分别命名为3B3和9D12. 纯化后的单克隆抗体3B3和9D12在1 mg/mL浓度下其抗体效价分别为740,741和359,712 units/mL. 利用制备的单抗结合激光共聚焦显微镜检测发现，膜结合型IgM位于B细胞膜表面(IgM+ B细胞). 流式细胞术检测尼罗罗非鱼IgM+ B细胞的免疫组织分布，发现IgM+ B细胞分布存在组织差异性，其中在外周血(PBL)所占比例最大，约为37.6%，其次是脾脏(SPL)，占百分比33.7%，头肾(AK)占比例约为23.9%，而后肾(PK)占比例约为20%. IgM+ B细胞荧光微球的吞噬能力分析发现，IgM+ B细胞对0.5 m的荧光微球吞噬能力强于1 m. 另外，IgM+ B细胞的吞噬能力存在免疫组织差异性，其中对于0.5 m荧光微球的吞噬，PBL明显高于其他组织，而AK IgM+ B细胞对1 m荧光微球的吞噬能力最强. 以上结果表明，本研究成功制备了鼠抗尼罗罗非鱼IgM单抗工具，并利用其IgM单抗发现IgM+ B细胞具有吞噬能力且其吞噬能力存在组织差异性，表明IgM+ B细胞在先天性免疫中可能发挥重要作用.     

天花粉蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞系的制备及鉴定

将小鼠骨髓瘤细胞（SP2／0细胞）与经TCS免疫过的小鼠脾细胞融合,融合后的细胞悬浮于HAT培养液中进行选择性培养,挑选可以分泌TCS单克隆抗体的细胞系,再经克隆化为单克隆细胞系。用间接酶联免疫吸附法检测此细胞系分泌单克隆抗体情况。经细胞融合和2次克隆化后,获得1株可以稳定分泌TCS单克隆抗体杂交瘤细胞系,ELISA检测结果为阳性。获得了可以稳定分泌天花粉蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系,为TCS鉴定、应用奠定良好的基础。     

人白血病抑制因子（hLIF）单克隆抗体的制备与鉴定

 为了获得抗人白血病抑制因子（hLIF）单克隆抗体,以重组hLIF蛋白为抗原,免疫Balb/c小鼠,采用传统的小细胞融合、无限稀释法制备了10株杂交瘤的腹水hLIF抗体,并对腹水进行了纯化.腹水粗品抗体经rProteinA一步亲和层析法纯化和鉴定后,抗体分子量都符合抗体的特性,抗体的纯度都达到了96.6%以上,抗体亲和常数在1.89×10-9~1.51×10-12mol/L,其中1B8a、5C1b、5G4a细胞株制备的抗体属于高亲和力抗体,可以对其的应用进行进一步的研究和探讨.     

柑桔速衰病毒株系特异性单克隆抗体的制备及其免疫学特性

以感染枸橼的柑桔速衰病毒(Citrustristeza virus,CTV)的部分纯化制备物和浓缩的感染组织粗浸出液免疫BALB/C小白鼠后获得的脾脏细胞,与鼠骨髓瘤细胞株P3-X63-Ag8.653融合制备了杂交瘤细胞.免疫小鼠的CTV株系为T514,杂交瘤细胞以有限稀释法获得纯克隆,并以健康枸橼和CTV不同株系感染枸橼的组织浸出液筛选各克隆,并确认各克隆与CTV各株系的免疫反应性.经以碱性磷酸酶标记的山羊抗鼠IgG进行酶联免疫吸附试验(EUSA),对各杂交瘤克隆的株系特殊性分析证明,从这些杂交瘤细胞中获得了能产生CTV株系特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株.     

Limited receptor repertoire in a mycobacteria-reactive subset of gamma delta T lymphocytes

The physiological role of lymphocytes bearing the gamma delta T-cell receptor (TCR) is still unclear. A function for a subset of these cells, however, is inferred from the finding that certain gamma delta chain-bearing lymphocytes are stimulated in a receptor-dependent fashion by mycobacterial antigens. We found that hybridomas derived from such cells in newborn murine thymus not only responded to mycobacterial purified protein derivative (PPD), but also exhibited an apparent autoreactivity. In neither response was haplotype-specific major histocompatibility (MHC) restriction demonstrable. To investigate the nature of antigen recognition by these gamma delta+ cells, we sequenced the gamma- and delta-chains from 28 PPD-reactive hybridomas, and found that a specific gamma-chain, together with one of a limited set of delta-chains, was needed to generate the PPD specificity. The reactive gamma delta pairs exhibited considerable junctional diversity, which may act to produce differences in the fine specificities of the responding cells.