花椰菜(Brassica oleracea var.botrytis)抗黑腐病差异表达cDNA片段的克隆及功能的初步研究

采用花椰菜抗黑腐病近等基因系C731(感病系)和C712(抗病系)作为材料,利用cDNA-AFLP技术,研究了花椰菜黑腐病抗性在黑腐病菌侵染和非侵染条件下基因表达的情况.获得了两个阳性克隆M2和M6.Nprthern杂交和点杂交进一步证明M2是组成型表达的cDNA片段,只是在病菌侵染与非侵染条件下表达丰度不同.而M6是差异表达的cDNA片段.Southern杂交表明M6 cDNA片段在花椰菜基因组中是单拷贝序列.随后的序列分析发现M6 cDNA片段与拟南芥1号染色体的BAC F19P19中66 665～66 813 bp有84%同源性,该片段编码拟南芥的2A6蛋白的部分序列.推测的氨基酸序列与拟南芥的2A6蛋白部分序列有91%同源性.用H2O2作为外源分子胁迫处理的初步功能分析发现:M6 cDNA片段受H2O2诱导,在诱导早期16～24 h高度表达,其在叶片中的积累呈逐渐上升趋势.根据序列分析和初步的功能分析的结果推测:M6 cDNA片段可能就是编码花椰菜中类2A6蛋白的部分基因片段.是参与花椰菜抗病反应信号途径的相关调控基因片段.     

花椰菜（Brassica oleracea vat．botrytis）抗黑腐病差异表达cDNA片段的克隆及功能的初步研究

采用花椰菜抗黑腐病近等基因系C731（感病系）和C712（抗病系）作为材料,利用cDNA—AFLP技术,研究了花椰菜黑腐病抗性在黑腐病菌侵染和非侵染条件下基因表达的情况．获得了两个阳性克隆M2和M6．Northern杂交和点杂交进一步证明M2是组成型表达的cDNA片段,只是在病菌侵染与非侵染条件下表达丰度不同．而M6是差异表达的cDNA片段．Southern杂交表明M6 cDNA片段在花椰菜基因组中是单拷贝序列．随后的序列分析发现M6cDNA片段与拟南芥1号染色体的BACF19P19中66665～66813bp有84％同源性,该片段编码拟南芥的2A6蛋白的部分序列．推测的氨基酸序列与拟南芥的2A6蛋白部分序列有91％同源性．用H2O2作为外源分子胁迫处理的初步功能分析发现：M6cDNA片段受H2O2诱导,在诱导早期16～24h高度表达,其在叶片中的积累呈逐渐上升趋势．根据序列分析和初步的功能分析的结果推测：M6cDNA片段可能就是编码花椰菜中类2A6蛋白的部分基因片段．是参与花椰菜抗病反应信号途径的相关调控基因片段．     

与花椰菜(Brassica oleracea ssp.botrytis)抗黑腐病基因连锁的RAPD标记

利用 RAPD技术 ,在花椰菜 ( Brassica oleracea ssp.botrytis)抗感黑腐病的近等位基因系之间进行 1 0碱基随机引物的筛选 .34 5条 RAPD引物扩增的产物表明 ,有 7条引物在近等基因系中呈多态性 .进一步的重复实验表明 ,只有引物 OP2 2 4能够产生稳定的多态性 .为了确定扩增产物 OP2 2 4/1 6 0 0与抗黑腐病基因的连锁程度 ,利用 F2分离群体进行检测 ,结果表明 :花椰菜种质 C71 2抗黑腐病生理种 BJ的抗性由一对显性基因控制 .RAPD标记OP2 2 4/1 6 0 0与抗病基因连锁 ,其遗传距离为 ( 4 .5± 1 .37) c M     

花椰菜(Brassica oleracea var.botrytis L.)凝集素的细胞凝集和糖抑制作用的研究

花椰莱(Brassica oleracea var. botrytis L.)凝集素能凝集兔、大鼠和小鼠的红细胞,其中对兔的红细胞的凝集活性最高,最低凝集浓度为0.68μg/ml。但不凝集我们所测试的其它16种红细胞。浓度为0.1mg/ml时,花椰菜凝集素也能凝集小鼠艾氏腹水瘤细胞,S_(180)肉瘤细胞,大鼠W_(256)肿瘤细胞、人的MGC_(80-3)胃癌细胞、小鼠和大鼠的脾脏淋巴细胞、骨髓细胞以及牛精子细胞,而不凝集人的Hela细胞。该凝集素对免的红细胞的凝集活性可被L—鼠李糖和D—树胶醛糖所抑制,最低抑制浓度分别为33.3m mol/L和16.7m mol/L。     

荔枝R基因同源序列的克隆与分析

根据已知植物抗病基因（R基因）编码的蛋白质NBS保守区设计特异简并引物，对荔枝的基因组DNA进行体外扩增，获得了一条大小约500bp的扩增谱带；回收该特异扩增带并进行克隆，筛选若干阳性克隆进行测序，共获得5个片段的序列。同源性比较发现，该5个片段均属于NBS－LRR类抗病基因同源序列（RGA），与已知R基因相应区段的氨基酸序列一致性为13.5%-45.9%。这些RGA既可进一步用于筛选荔枝的抗病候选基因，同时也可以作为分子标记，用于荔枝遗传图谱的构建。该研究表明R基因同源克隆技术可望成为荔枝抗病基因克隆和基因组研究的重要手段。     

花椰菜花药培养试验研究

以杂交品种B-21为材料,对花椰菜的花药培养条件进行了分析。试验结果表明:花药消毒处理采用0.1%升汞消毒30min效果较好,成活率达86.67%;E3培养基愈伤组织诱导率为86.11%,比MS培养基提高4.40%;用培养基MS 0.5 mg/L6-BA 0.5 mg/L NAA出芽率为31.67%,分化绿苗率为94.79%;用生根培养基1/2 MS 0.1 mg/L NAA 活性碳2 g/L生根率达100%。     

花椰菜自交不亲和性的分子标记研究

运用随机扩增多态性DNA(RAPD)和inter-简单重复序列(ISSR)等分子标记技术,分别对5组花椰菜自交不亲和系和对应的自交亲和系的基因组进行指纹差异分析.采用10个10 mer随机引物和5个ISSR引物进行PCR扩增,结果表明,扩增片段分子量在0.3～5 kb之间,指纹图谱的稳定性和重复性较好.经过3次以上重复发现,ISSR4引物扩增图谱中,自交亲和系比不亲和系多扩增出3 800 bp片段;ISSR6引物扩增图谱中,除第3组外,不亲和系比亲和系多扩增出1 100 bp片段.结果表明,花椰菜自交不亲和系与自交系基因组DNA之间存在差异,扩增出的差异片段与花椰菜自交不亲和性相关,并可作为自交不亲和系和自交亲和系育种筛选的分子标记.初步探讨了花椰菜自交不亲和性的遗传机制及RAPD和ISSR技术在自交不亲和系选育过程中的应用前景.     

紫苏霉素抗性基因srm1的克隆及其特性研究

从伊纽小单孢菌（Micromonosporain inyoensis）扩增到包含紫苏霉素抗性基因srm1的DNA序列LY102（847bp）,并将其克隆到pUC19／18载体上．srm1基因是依靠它自身的启动子激活（ATG上游19bp序列）,在E．coli DH5α中表达,并不受lac启动子的控制．其开放性阅读框长819bp,编码含273AA的多肽链预测的Srm1蛋白序列与Gmd3（来自玫瑰小单孢菌）、GrmA（来自绛红色小单孢菌）和Sgm（来自兹昂小单孢菌）的同源性依次为92％,89％和85％．srm1,grmA,grmB和sgm4个抗性基因具有相同的核糖体结合位点GGAGG,但是它们的核糖体结合位点与翻译起始密码子之间的序列互不相同．基因srm1以自阻遏方式在翻译水平上进行调节。     

ACC氧化酶反义基因转化青花菜的研究

以青花菜的下胚轴和带1～2mm子叶柄的子叶为转化受体，建立了根癌农杆菌介导的转化体系，获得了含番茄果实ACC氧化酶反义基因的转基因植株。经筛选获得了5株抗性植株，其中1株来自下胚轴，另外4株来自带子叶柄的子叶。PCR及Southern blot检测证实，外源．ACC氧化酶反义基因已整合进其中2株拟转化青花菜植株的基因组。转化植株移栽到室外均能成活，成熟小花蕾的乙烯测定结果表明乙烯的合成受到了不同程度的抑制。     

人类抗砷相关基因hARRG全长cDNA的克隆和在E.coli中表达

通过对构建的人胎脑cDNA文库进行大规模测序,发现一条人类新基因,序列与仓鼠asr2序列高度同源,达88％,命名为人类抗砷相关基因（human arsenic resistance related gene.hARRG),hARRG与抗砷基因相关序列ARS2（AF082871）几乎完全全同源,仅比它短253bp,hARRG并不是全长基因而仅是一个cDNA片段,为了获得hARRG全长cDNA,运用Northern blot电子RACE和5－SMART－RACE的方法克隆了一条2999bp 的hARRG全长cDNA,通过Unigene染色体定位于7q21.3,经过生物信息学分析发现,该cDNA有完整的读码框,编码一个788个氨基酸的蛋白,预计分子质量为89．2ku,并在大肠杆菌中获得了成功表达。