拟南芥CARK4与RCAR12相互作用的研究

本研究采用酵母双杂交(Y2H)、GST-融合蛋白沉降技术(GST-pull-down)及双分子荧光互补实验(BiFC)实验方法研究蛋白质激酶CARK4与脱落酸受体RCAR12之间的相互作用.酵母双杂交(Y2H)试验显示,缺失氮端的CARK4(CARK4ΔN)与RCAR12具有明显的相互作用.体外GST-融合蛋白沉降技术试验进一步得出CARK4能拉下RCAR12,而不能结合负对照GST,这证明CARK4可以直接与RCAR12相互作用.为了确定CARK4与RCAR12在植物体内是否也存在相互作用,利用农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达来进行BiFC实验,结果表明在烟草中共注射CARK4与RCAR12能发激发荧光,而负对照却没有,这说明CARK4与RCAR12在植物体内存在相互作用.研究结果表明,CARK4与RCAR12在植物体内、体外均具有相互作用.     

拟南芥蛋白质激酶CARK7与ABA受体RCAR12相互作用的研究

脱落酸(ABA)受体RCARs在ABA信号传导过程中起关键作用,研究ABA受体的相互作用蛋白质对进一步了解植物抗逆的分子机制有重要的意义.本研究通过酵母双杂交发现CARK7与ABA受体RCAR12共转化酵母能在营养缺陷型平板SD/-Trp-Leu-Ade上生长.将CARK7与RCAR12分别克隆到原核表达载体pET-28a(+)和pGEX-6p-1中,构建融合蛋白表达载体,并进行原核表达和亲和纯化.纯化所得蛋白进行GST-pull down实验,结果表明RCAR12能够把CARK7蛋白拉下来.上述结果说明CARK7与RCAR12在体外存在相互作用.进一步通过双分子荧光互补实验发现CARK7与RCAR12在烟草叶片表皮细胞中能产生荧光信号,说明两者在体内同样具有明显的相互作用.     

拟南芥AtDWD与RCAR1相互作用的初步研究

采用pull down和酵母共转化的方法研究了AtDWD与RCAR1之间的相互作用.体外pull down试验得出AtDWD与RCAR1之间存在明显的相互作用;酵母共转化试验显示AtDWD的截断区域中只有WD45和WD345转化子可以在SD四缺培养基平板上长出正常的酵母菌落.实验结果表明,AtDWD C端的145~350位氨基酸序列中含有与RCAR1相互作用的功能域.     

拟南芥AtMYB44与RCAR1相互作用的研究

以拟南芥脱落酸(ABA)受体RCAR1和以文为诱饵蛋白质,利用酵母双杂交(Y2H)技术筛选出转录因子AtMYB44,本文进行了pull down及重转酵母验证,确定它们之间的关系,实验结果显示RCAR1与AtMYB44之间确实存在相互作用.此外,为了确定RCAR1在AtMYB44上的作用区域,构建了不同长度的AtMYB44cDNA序列的PGADT7载体,利用酵母双杂交实验分析,表明只有AtMYB44的N端54~105氨基酸序列与RCAR1存在相互作用.     

ABA受体RCAR1/PYL9相互作用蛋白质的筛选及初步研究

使用拟南芥作为模型,采用酵母双杂交系统筛选出和ABA受体RCAR1/PYL9有相互作用的蛋白质,以更深入的研究RCAR1/PYL9的功能.首先利用反转录PCR方法获得拟南芥的cDNA,然后通过酵母双杂交系统,用拟南芥RCAR1/PYL9作为诱饵蛋白对拟南芥cDNA文库进行筛选,并获得多个阳性克隆.对该菌落进行进一步的鉴定得到与RCAR1/PYL9具有相互作用的蛋白质,这对进一步研究RCAR1/PYL9及其相互作用蛋白质在ABA信号转导途径中的作用及地位奠定了基础.     

拟南芥AtDWD与ABI2相互作用的初步研究

本文以RCAR1为诱饵蛋白通过酵母双杂交（Y2H）技术筛选出了DWD基因编码的蛋白,同时在用ABI2参与筛选的过程中,同样得到了DWD这个基因. 进行了pull down 实验验证它们之间的相互作用,实验结果显示：在体外,RCAR1、RCAR3与DWD之间确实存在相互作用,同时ABI2与DWD也存在相互作用. 其后对DWD结构的进行分析和实验,发现ABI2和DWD的相互作用区域集中在AtDWDC端,大概是145~350位氨基酸之间的WD40结构域里.     

酵母双杂交筛选与脱落酸受体相互作用的蛋白质及其重转酵母的验证

脱落酸（abscisic acid,ABA）是一种重要的植物激素,它能使植物适应逆境胁迫,从而调节植物的生长发育状况.现今ABA受体已被公认为RCARs/PYR/PYLs家族蛋白.本实验通过拟南芥为模式植物,利用酵母双杂交系统共转化方法从拟南芥cDNA文库中筛选与RCAR3相互作用的蛋白质,获得多个阳性克隆,从中选取一个与生长素调节相关的基因NIT1的全长cDNA重新转化酵母验证,发现与RCAR3仍然有相互作用,排除了假阳性的可能.从而为下一步研究该基因与RCAR3的相互关系做好了准备.     

拟南芥CARK5激酶响应脱落酸信号的研究

为了研究拟南芥脱落酸（Abscisic acid,ABA）受体的翻译后修饰,本研究以能够磷酸化ABA受体的激酶CARK5作为研究对象,通过构建了转基因株系来检测CARK5在ABA信号途径中的功能.结果显示： CARK5能够促进ABA介导的抑制种子萌发、幼苗的形态建成以及主根的生长,但是过表达激酶失活型CARK5m（CARK5N250A）则跟突变体cark5表型类似.拟南芥中过表达CARK5增强植株抗旱性;ABA处理后,ABA响应标记基因RAB18表达量增加.这些结果说明,CARK5通过可以磷酸化ABA受体,正调控ABA信号通路.     

拟南芥钙依赖蛋白激酶CPK12与bZIP转录因子ABF4相互作用研究

为分析拟南芥钙依赖蛋白激酶CPK12在不同物种中序列的相似性,并研究CPK12与ABA信号通路的关系,本研究对不同物种CPK12氨基酸序列进行比较,以及通过体内和体外实验验证CPK12与ABF4之间是否存在直接相互作用关系.通过对拟南芥(Arabidopsis thaliana),油菜(Brassica napus)与荠菜(Capsella rubella)等物种的同源氨基酸序列进行比较,获得了它们的亲缘关系.利用酵母双杂交系统,将CPK12与ABF4共转酵母后,在四缺型培养基上能够正常生长,这说明CPK12与ABF4在体外有相互作用.同时,利用双分子荧光互补实验,CPK12与ABF4共转烟草后能够在激发光下观察到烟草细胞核中出现明显荧光信号,这说明CPK12与ABF4在植物体内也存在相互作用,为CPK12参与ABA信号途径提供了直接证据.     

与拟南芥TR1相互作用的蛋白质筛选和鉴定

TR1是一个定位于质膜上的E3连接酶,前期的研究表明它可赋予多种植物对盐、干旱和热胁迫的耐受性。但是,其发挥功能的分子机制尚不清楚,与其存在相互作用的靶蛋白也未找到。本研究利用酵母双杂交系统以AtTR1-△119为诱饵蛋白筛选拟南芥归一化通用型cDNA文库,结果获得了13个与其有潜在互作的候选蛋白。经酵母正向和反向多次验证发现转化了TR1与CURT1C和TR1与SWEET5的酵母在三缺和四缺培养基中均正常生长,而且在含有X-α-gal的培养基中出现蓝斑。双分子荧光互补技术证明TR1与CURT1C和SWEET5之间也有相互作用,这对进一步研究AtTR1及其相互作用蛋白质在植物抗逆中的作用和分子机制奠定了基础。     

AtMYB44与ABI1竞争性结合ABA受体RCAR1的研究

为了进一步确定AtMYB44、ABI1、RCAR1三者之间的关系,本文进行了竞争性pull down和ABI1磷酸酶活性的测定实验,结果表明AtMYB44与ABI1能够竞争性结合RCAR1,并且这种竞争性结合依赖于ABA,AtMYB44能够降低RCAR1对ABI1活性的抑制,这为深入研究ABA信号转导途径奠定了基础.     

一种基于荧光检测的GST-pull down改进方法的建立及对Atsttrin-TNFR2相互作用的分析

创建一种基于荧光检测的GST-pull down改进方法,用于蛋白质间相互作用分析.利用已确定具有相互作用的Atsttrin和TNFR2蛋白对作为实验对象,分别构建GST-Atsttrin和TNFR2-EYFP融合蛋白的原核和真核表达体系.将纯化的GST-Atsttrin与TNFR2-EYFP蛋白孵育后,经离心收集复合物,通过酶标仪检测其荧光值,从而分析Atsttrin和TNFR2间的相互作用.通过荧光值的检测成功分析了Atsttrin和TNFR2间的相互作用,荧光值的检测可代替传统方法中的Western blot分析,从而简化GST-pull down分析步骤、降低操作难度、并可对缺乏特异性抗体的靶蛋白进行有效地分析.     

NT3的酵母双杂交诱饵载体的构建和初步鉴定

构建和转化神经营养素3(neurotrophin 3,NT3)的酵母诱饵重组质粒,为通过酵母双杂交研究NT3的功能及作用机制奠定基础。用PCR扩增NT3基因cDNA中编码完整开放读框的基因片段;将该基因片段与pLexA载体定向重组;用酶切和测序鉴定重组质粒;将核苷酸序列正确的重组质粒转化入EGY48[p8op LacZ]酵母菌株。结果成功构建pLexA NT3重组质粒。转化有重组质粒和pLexA空载体的二种EGY48[p8op LacZ]酵母都能在SD Gal Raf His Ura培养基中长成白色菌落(同时,转化pLexA pos阳性对照质粒的酵母菌在相同条件下长成蓝色菌落),但都不能在SD His Leu Ura培养基中生长,在SD His Ura液中培养16h后,OD600均值均为0.8±0.1。这表明,重组质粒表达的融合蛋白没有激活LEU2和lacZ酵母报告基因表达的活性,也没有酵母毒性作用。因此,构建的诱饵重组质粒可以用于下一阶段的人胎脑cDNA文库筛选。     

拟南芥At5g66070基因在ABA处理下的初步研究

本研究以拟南芥为实验材料,探索基因At5g66070在植物激素ABA处理条件下的相关生理功能.结果表明,在10μMABA处理下,该基因的表达量明显升高,表明该基因受到ABA的诱导.亚细胞定位发现AT5G66070定位在细胞核.通过DNA及RNA水平筛选鉴定At5g66070基因T-DNA插入纯合突变体,然后经根瘤农杆菌介导法进行遗传转化,筛选获得过表达转基因株系.表型分析发现经ABA处理后,突变体相对于野生型而言根长较短,表明突变体对ABA更为敏感.气孔关闭实验发现10μM ABA能诱导突变体气孔关闭,而野生型和过表达无显著影响.以上结果表明At5g66070在拟南芥的ABA胁迫响应中起负调控作用.     

拟南芥AtHHR3响应热胁迫应答的初步分析

拟南芥基因AtHHR3编码一个RING结构域的E3连接酶,通过生物信息学分析发现其可能参与植物热胁迫相关的应答.为了探索其具体的功能,构建了AtHHR3互补株系,并在DNA水平和转录水平分别鉴定了AtHHR3互补株系,用RT-PCR技术分析了AtHHR3在热处理条件下基因表达的变化情况.在热胁迫下分析了野生型、突变体athhr3、回复株系幼苗存活以及种子萌发的表型变化情况,发现突变体athhr3表现出对热胁迫的耐受性,并检测了热胁迫下不同株系的HSF、HSP等热相关基因的转录水平的变化,初步的研究表明拟南芥基因AtHHR3负调控植物对热胁迫的耐受性.     

高介电常数CaCu_3Ti_4O_(12)陶瓷材料的研究现状

CaCu3Ti4O12(CCTO)陶瓷材料因具有反常的高介电常数以及优异的温度稳定性而显示出广泛的应用前景.介绍了CCTO陶瓷材料的晶体结构、制备方法、介电性能和微观介电机制,综述了CCTO陶瓷材料的介电性能改性方面的研究现状.