水稻原生质体高频分裂及基因转化

从粳稻品系８９８和籼稻不育系珍籼Ａ的悬浮细胞系中制备的原生质体，分裂频率分别达１８．９％和３５％。低压脉冲电泳仪介导外源基因转移的水稻原生质体，分裂频率也在１０％以上，转化的小细胞团中检测到外原基因Ｇｕｓ的表达，对原生质体的制备、培养及转化作了下述改进：（１）添加２μｇ／Ｌ２，４－Ｄ的Ｎ６培养基培养悬浮细胞及原生质体可获高频分裂，添加０．３μｇ／Ｌ６－ＢＡ或０．１μｇ／Ｌ ＮＡＡ不利于分裂；（２）     

克隆蓝藻Calothrix sp.PCC7601 cpcB2A2基因的初步研究

从蓝藻Ｃａｌｏｔｈｒｉｘｓｐ．ＰＣＣ７６０１染色体ＤＮＡ中分离出含藻蓝蛋白基因ｃｐｃＢ２Ａ２的略３．８ＫｂＤＮＡ片段，与质粒ｐＵＣ１８重组，构建成一种重组质粒，ｐＰＣ２１８－ＰＣＺ，转化Ｅ．ｃｏｄｉＪＭ１０９，获得了一系列克隆子，经斑点分子杂交和限制性内切核酸酶分析，筛选出了初步认为含有ｃｐｃＢ２Ａ２基因的克隆子。     

蓝细菌新质粒载体pPRS－1的构建

以蓝细菌Ｐｌｅｃｔｃｎｅｍａｂｏｒｙａｎｕｍ内源小质粒ｐＰｂｓ（１．５ｋｂ）和Ｅ。ｃｏｌｉ质粒载体ｐＢＲ３２２（４．３ｋｂ）为材料，用限制性内切核酸酶ＣｌａⅠ分别消化，经Ｔ＿４ＤＮＡ连接酶连接，转化Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１感受态细胞，在含Ａｍｐ（Ａｐ）和含Ｔｅｔ（Ｔｃ）的ＬＢ琼脂培养基上筛选出Ａｍｐ￣ｒＴｅｔ￣ｓ的转化子，提取转化子的质粒，用ＣｌａⅠ消化，得１．５ｋｂ和４．３ｋｂ两片段，表明转化子所含质粒是ｐＰｂｓ和ｐＢＲ３２２的重组质粒，定名为ｐＰＲＳ－１。     

林可链霉菌噬菌体φSL60启动子的克隆与鉴定

以启动子探针质粒ｐＩＪ４８６为载体,变铅青链霉菌（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２３作受体,克隆了林可链霉菌噬菌体ＳＬ６０ＤＮＡ上的启动子活性片段。以ｐＵＣ１８为载体构建ＳＬ６０ＤＮＡ之ＫｐｎＩ片段的基因文库,从中筛选出两个片段,分别克隆于ｐＩＪ４８６中获得ｐＵＩＳ２９和ｐＵＩＳ１９８,在ＭＭ培养基上,两者的转化子对卡那霉素的抗性均仅为１０ｍｇ／Ｌ。噬菌体ＳＬ６０ＤＮＡ的ＢｇｌＩ片段直接克隆入ｐＩＪ４８６的ＢａｍＨＩ位点,获得重组质粒ｐＭＭＳ１,其转化子的卡那霉素抗性在ＭＭ培养基上可达２５０ｍｇ／Ｌ。分析表明ｐＭＭＳ１上的插入片段约为９２０ｂｐ,含有一个ＳｓｔＩ位点,四个ＭｂｏＩ位点。该片段用ＭｂｏＩ部分酶解缩小到６００ｂｐ,亚克隆入ｐＩＪ４８６中得到重组质粒ｐＭＳＢ１４,其转化子对卡那酶素的抗性水平提高到３００ｍｇ／Ｌ。ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳显示,ｐＭＳＢ１４中的ｎｅｏ基因可以表达出氨基糖苷磷酸转移酶（ＡＰＨＩ蛋白）。这些结果表明ｐＭＳＢ１４中的插入片段可能具有较强的启动子活性。     

枯草芽孢杆菌TF2磺胺胍抗性基因的克隆和表达

采用鸟枪法将枯草芽孢杆菌磺胺胍抗性基因克隆到质粒ｐＵＢ１１０中建成重组质粒,ｐＢＵＷ４,该质粒的分子量约８．１ｋｂ,标记为ＳＧ＾ｒ为Ｋｍ＾ｒ,将ｐＵＢＷ４转化到肌苷产生菌枯草芽孢杆菌Ｑ２９０１－４菌株中,得到的转化子产肌苷能力比受体菌提高２５．５％。     

恶臭假单胞菌萘质粒ⅠNL基因的克隆及酶切图谱

恶臭假单胞菌（ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＧ７）携带的质粒ＮＡＨ７，经限制性内切酶ＥｃｏＲＩ切割后，产生含有萘降解酶全部基因（２４，６ｋｂ）的片段，此片段插入到载体ｐＵＣ１１９的多克隆位点，构成了ｐＫＡＯ质粒，此质粒经ＨｐａＩ，ＥｃｏＲＩ酶切获得的５．１ｋｂ片段亚屯隆到ｐＵＣ１１９中，衍生出ｐＮＮ１质粒，绘制出内切酶图谱。从ｐＮＮＩ质粒上切下含目的基因ｎａｈＩ、ｎａｈＮ和ｎａｈＬ的ｋｐｎＩ－ｋｐｎＩ片段（２．３ｋｂ）．正向插入载体ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＳＫ＋中获得重组质粒ｐＮＮ２，反向插入为ｐＮＮ３，将其转化到大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ中，目的基因得以大量增殖。     

生长调节剂对香石竹茎尖诱导形成芽的影响

将香石竹的茎尖作为外植体，分别接种于添加不同量细胞分裂素（６－ＢＡ或ＫＴ）及生长素（ＮＡＡ）的ＭＳ琼脂培养基上，结果表明，培养基中如果只添加６－ＢＡ或ＫＴ，当两者浓度分别在（０．０１－０．５）ｍｇ／Ｌ和（０．０１－１）ｍｇ／Ｌ时，对芽的产生起促进作用；在大于０．５ｍｇ／Ｌ和１ｍｇ／Ｌ时，则抑制芽的产生，培养基中同时加入ＮＡＡ和６－ＢＡ或ＫＴ，在ＮＡＡＲ 最小于６－ＢＡ或ＮＡＡ和ＫＴ时，利于芽的形成     

骆驼刺高效离体植株再生体系的建立

通过对络驼刺（Ａｌｈａｇｉ ｐｓｅｕｄａｌｈａｇｉ Ｄｅｓｖ）不同外植体来源、不同培养基及激素配比的比较,建立骆驼刺培养高效再生植株实验体系。表明骆驼刺下胚轴切段在含１．５￣２．０ｍｇ／Ｌ２,４－Ｄ和０．５￣１．０ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ的ＭＳ培养基中１００％诱导愈伤组织,在含１．５ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ和１．０ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ的ＭＳ培养基上愈伤组织分化成苗,转至含２．０ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ和０．２ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ的ＭＳ培养基上成根得到完整再生植株,组织学观察表明植株再生主要为器官发生途径,染色体稳定遗传。     

正交设计法在白三叶组织培养中的应用

以白三叶的叶片为外植体,采用正交设计法,对愈伤组织生长和细胞悬浮培养的培养基进行了优化筛选。实验结果表明,白三叶叶片愈伤组织生长的最佳培养基配方为ＭＢ＋０．５ｍｇ／Ｌ ２,４－Ｄ＋０．２ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋１ｍｇ／Ｌ ＢＡ＋２ｍｇ／Ｌ甘氨酸＋１００ｍｇ／Ｌ肌醇＋３％蔗糖＋０．７％琼脂;细胞悬浮培养的最佳培养基的配方为ＭＢ＋４ｍｇ／Ｌ ２,４－Ｄ＋０．２ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋０．５ｍｇ／Ｌ ＢＡ＋２ｍｇ／     

乙型肝炎病毒(HBV)DNA免疫的初步研究

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增了编码ＨＢＶｓＡｇ的基因序列,将其插入到ｐｃＤＮＡ３载体中,位于人巨细胞病毒（ＣＭＶ）早期启动子下游．重组质粒ｐｃＤＮＡ３－ｓＡｇ转染细胞后检测到ＨＢｓＡｇ表达．用纯化后的重组质粒直接注射到ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠骨骼肌内,诱发实验小鼠产生了抗ＨＢｓＡｇ特异性抗体．ＰＣＲ扩增未检测到注射部位及肝脏细胞染色体中有外源ＨＢＶＤＮＡ整合     

钝齿棒杆菌YL_1基因文库的建立及异亮氨酸基因在大肠杆菌中的克隆表达

以ｐＵＣ１９质粒为载体建立了异亮氨酸产生菌钝齿棒杆菌（Ｃｏｒｙｍｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｃｒｅｎａｔｕｍ）ＹＬｌ的基因文库，并通过酶切重组子、斑点杂交得到证实．共筛选５８００个重组子，一个特定ＤＮＡ片断在库中存在的可靠性达９９．９９％．从中克隆重组了带有ｉｌｖＡ基因片断的重组质粒ｐＹＩ９４，转化ＡＨＶ的大肠杆菌ＥＤ８６５４－５，使本来不产Ｉｌｅ的大肠杆菌可以积累Ｉｌｅ１．５ｇ／Ｌ，为进一步高效表达构建工程菌创造了条件．     

钝齿棒杆菌YL1基因文库的建立及异亮氨酸基因在大肠杆菌…

以ｐＵＣ１９质粒为载体建立了异亮氨酸产生菌钝齿棒杆菌ＹＬ１的基因文库，并通过酶切重组子、斑点杂交得到证实，区筛选５８００个重组子，一个特定ＤＮＡ片断在库中存在的可靠性达９９．０９％。从中克隆重组了带有ｉｌｖＡ基因片断的重组质粒ｐＹ１９４转化ＡＨＶ的大肠杆菌ＥＤ８６５４５，使本来不产Ｉｌｅ的大肠杆菌可以积累Ｉｌｅ１．５ｇ／Ｌ，为进一步高效表达构建工程菌创造了条件。     

紫云英根瘤菌结瘤基因调控片段克隆和分析

通过对紫云英根瘤菌７６５３Ｒ及其Ｎｏｄ－突变株７６５３Ｒ－１侵染根毛试验证实,７６５３Ｒ菌株３１８×１０３ｂｐ大质粒决定早期结瘤功能,分子杂交结果显示,其ｎｏｄＤＡＢＣ定位于该质粒上．将７６５３Ｒ菌株的大质粒ＤＮＡ进行酶切并克隆到表达载体ｐＭＰ２２０上,构建ｌａｃＺ重组子文库,将ｌａｃＺ重组子文库导入７６５３Ｒ菌株,在加有Ｘ－ｇａｌ和种子浸提物的根瘤菌培养基上选择蓝色菌落．通过Ｍｉｌｅｒ试验测定它们的β－半乳糖苷酶活性,获得１株种子浸提物对其有诱导效应的菌株ＨＮ１８,对该菌株所含的重组质粒ｐＨＮ１８进行ｎｏｄＤＡＢＣ探针杂交,发现有１条１．７×１０３ｂｐ的阳性杂交带,说明在ｐＨＮ１８中克隆有结瘤基因启动子     

环状芽胞杆菌（Bacilluscirculans）的转化和中性蛋白酶基因的表达

用枯草芽胞杆菌质拉载体ｐＮＱ１２２和含有中性蛋白酶基因的重组质粒ｐＭＰＲ８转化环状芽胞杆菌Ｃ－２，转化频率为１．０×１０３转化子／μｇＤＮＡ．含有ｐＭＰＲ８的转化子能在酪蛋白平板上形成清晰的水解圈，其蛋白酶活性与相同质粒转化枯草杆菌ＤＢ１０４所得酶活性相近．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果证实了转化细胞中存在质粒ｐＮＱ１２２和ｐＭＰＲ８，两种质粒在该菌中的稳定性差别很大．     

蓝细菌新质粒载体pPRS—1的构建

以蓝细胞Ｐｌｅｃｔｏｎｅｍａ ｂｏｒｙａｎｕｍ内源小质粒ｐＰｂｓ（１．５ｋｂ）和Ｅ．ｃａｌｉ质粒载体ｐＢＲ３２２（４．３ｋｂ）为材料，用限制性内切核酸酶ＣｌａＩ分别消化，经Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转化Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１感受态细胞，在含Ａｍｐ（Ａｐ）和含Ｔｅｔ（Ｔｃ）的ＬＢ琼脂培养基上筛选出Ａｍｐ＾ｒＴｅｔ＾ｓ的转化子，提取转化子的质粒，用ＣｌａＩ消化，得１．５ｋｂ和４．３ｋｂ两片段，表明转化子     

播娘蒿子叶及下胚轴诱导再生植株的研究

用揪娘嵩种子,在附加６－ＢＡ０．５～１．０ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．１ｍｇ／Ｌ的ＭＳ培养基上获得无菌苗,幼苗的下胚轴在含６－ＢＡ０．１ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．５ｍｇ／Ｌ的ＭＳ培养基上的出愈情况最佳,将来自下胚轴的愈伤组织培养了含有６－ＢＡ２．０ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．２ｍｇ／Ｌ的ＭＳ培养基上分化出的丛生芽状态最好,最佳生根培养基为１／２ＭＳ＋ＩＢＡ０．５ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．０５ｍｇ／Ｌ。     

耐碱细菌NTT36耐碱基因的克隆及表达产物的分析

耐碱芽孢杆菌ＮＴＴ３６总ＤＮＡ经ＥｃｏＲ１酶不完全消化,与质粒ｐＵＣ１８的ＥｃｏＲＲＩ酶切产物在体外重组后,转化大肠杆菌ＨＢ１０１,在碱性平板上直接筛选耐碱转化子,转化经检测具有氨苄青霉素抗体,分析表明转化子具有１５ｋｂ大小的重组质粒,用此重组质粒转化大肠杆菌ＨＢ１０１,ＤＨ５ａ和ＸＬ１－Ｂｌｕｅ,均产生大量同时具有耐碱性和Ａｍｐ抗性的转化子,通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和点杂交证明此重组质粒（定名为     

生长调节物质对丹参叶片脱分化及根芽分化的效应

生长调节物质对丹参叶片脱分化及根芽分化效应的研究结果表明：（１）０．５～５．０ｍｇ／Ｌ２，４－Ｄ，０．１～０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ０．５～１．５ｍｇ／ＬＩＢＡ或０．２～１．０ｍｇ／Ｌ４ＰＵ－３０诱导叶片的脱分化率高达９７％～１０００％。（２）０．１～０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ或０．５～２．０ｍｇ／ＩＢＡ诱导芽化率为９３％～１００％，３种细胞分裂素中，４ＰＵ－３０对叶片芽化最有效，６－ＢＡ和ＫＴ次之。（３）随     

人胰岛素原乳腺表达载体的构建

通过ＰＣＲ方法扩增了人胰岛素（ＨＩ）基因１．３４ｋｂ的ＤＮＡ片段并克隆于ｐＵＣ１８的ＳｍａⅠ位点内。经ＤＮＡ序列分析表明，该片段为ＨＩ基因的氨基酸编码区及３＇端调控区序列。同时，应用ＰＣＲ方法对牛α－乳白蛋白（ＢαＬＡ）基因进行了扩增，得到了０．８４ｋｂＤＮＡ扩增片段。将其克隆于去除了ＥｃｏＲＩ位点的ｐＵＣ１８ＳｍａＩ位点内，经内切酶分析和ＤＮＡ测序证明该片段是ＢαＬＡ基因５＇调控区序列。ＥｃｏＲ     

将GNA基因导入莴苣（L.sativa）及其表达的研究

将含ＣａＭＶ３５Ｓ启动子的雪花莲凝集素基因置换Ｔｉ质粒载体ｐＢＩ１２１中的ＧＵＳ基因得到了ｐＢＩＧＮＡ质粒,将其导入农杆菌ＬＢＡ４４０４,得到ＬＢＡ４４０４菌株。