通过远缘杂交将鸭茅状摩擦禾DNA片段导入普通小麦基因组的分子证据

报道了小麦与鸭茅状摩擦禾杂交后代的分子生物学分析结果.利用RAPD技术在340个随机引物中筛选出2个引物,它们在杂交后代稳定株系中扩增出父本鸭茅状摩擦禾所具有的特异条带.在分子水平上证明了鸭茅状摩擦禾DNA可通过有性杂交方式整合到小麦基因组中.随后的RFLP分析进一步证实了这一结论.论证了利用小麦与鸭茅状摩擦禾有性杂交的方法向小麦基因组转移鸭茅状摩擦禾DNA在育种实践及理论研究方面的意义和潜力.     

普通小麦7B染色体的显微分离和低拷贝专化DNA序列的克隆

以普通小麦“中国春”７Ｂ单体的花粉母细胞为材料,显微分离出７Ｂ染色体。经蛋白酶Ｋ和ＤＮＡ拓扑异构酶Ｉ处理后进行１￣３轮ＤＯＰ－ＰＣＲ扩增,产生了１５０￣７００ｂｐ的连续ＤＮＡ片段。基因组Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实扩增的ＤＮＡ源自小麦基因组。将大于２００ｂｐ的第３轮ＰＣＲ扩增产物（５０μＬ）克隆后,可产生２００００个重组克隆。对随机选取的５０个克隆分析表明,其中２１个克隆产生了大小为２４０￣６００ｂｐ     

耐旱植物厚叶旋蒴苣苔BDN1脱水素基因的克隆及表达特性分析

根据已知植物脱水素基因保守区域设计引物,采用ＲＴ－ＰＣＲ方法从耐旱植物厚叶旋蒴苣苔的总ｃＤＮＡ中扩增出一个５００ｂｐ的与植物脱水素基因同源的序列。结合５’ＲＡＣＥ获得了植物脱水素基因家族一个新成员ＢＤＮ１的全长ｃＤＮＡ（１１４８ｂｐ）。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析表明,ＢＤＮ１基因在厚叶旋蒴苣苔基因组中以单拷贝形式存在,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交结果表明,该基因的表达受干旱,寒冷及ＡＢＡ的诱导。推测该基因与     

小麦中一个PDR型ABC转运蛋白基因的克隆和特征分析

脱氧血腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)在小麦赤霉病发病过程中起重要作用, 是一种毒性因子. 禾谷镰刀菌的侵染能力依赖于其产生DON的能力, 抗病品种能显著降低病穗组织中DON的含量. 本研究利用Affymetrix小麦基因组芯片, 对抗赤霉病小麦品种望水白经DON诱导后的穗组织基因表达特点进行了分析, 结果发现, 一个编码PDR型转运蛋白的EST受DON诱导后上调表达45倍. 根据该EST设计引物筛选小麦基因组TAC文库, 得到一个包含该基因的TAC单克隆. 利用染色体walking对该单克隆测序, 用Softberry软件进行基因预测, 根据预测基因的5′和3′非翻译区设计引物, 从DON诱导的小麦望水白穗组织cDNA中克隆出该转运蛋白基因. 该基因组全长7377 bp, 包含19个外显子, CDS长度为4308 bp, 编码长1435 aa且分子量161 kD的蛋白. 蛋白序列比对表明, 该基因属于PDR蛋白家族, 命名为TaPDR1 (Triticum asetivum Pleiotropic Drug Resistance). 利用一套中国春缺体-四体系将TaPDR1基因定位在小麦5A染色体上. 半定量RT-PCR表明, TaPDR1在望水白穗中受DON和禾谷镰刀菌诱导表达, 表明其参与了植物抗病防御反应. 该基因在望水白感病突变体中低水平表达, 进一步证明TaPDR1与赤霉病抗性有关. TaPDR1的表达不受与生物胁迫相关的激素(JA和SA)和非生物胁迫因子(热、冷、伤害和NaCl)的诱导, 但受到Al³⁺和游离Ca²⁺的诱导表达, 推测[Ca²⁺]i介导了TaPDR1的表达信号.     

水分胁迫诱导表达的小麦基因的cDNA片段克隆和序列分析

以３０％（－１．３１ＭＰａ）ＰＥＧ－６０００对小麦幼苗进行重度水分胁迫处理,利用ｍＲＮＡ差异显示技术分离了水分胁迫诱导表达的小麦基因ｄｉｌｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ,ｄｉ１）的ｃＤＮＡ片段,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析表明,ｄｉ１基因在水分胁迫１０ｈ后表达开始增强并随着水分胁迫时间的延长而增强,水分胁迫４８ｈ时其表达最强。对ｄｉｌ基因的ｃＤＮＡ片段进行了克隆和序列测定（２１１ｂｐ）     

天然雌核发育银鲫与两性生殖彩鲫卵母细胞中蛋白激酶基因表达差异的比较

采用ｍＲＮＡ差异显示方法,以蛋白激酶基因家族保守区的设计５′引物,比较天然雌核发育银鲫和两性生殖彩鲫母卵细胞中蛋白激酶基因的表达,结果表明,以引物Ｔ１２ＭＡ,Ｔ１２ＭＣ和Ｔ１２ＭＧ合成的ｃＤＮＡ第１链分别再经蛋白激酶特异引物扩增所得到的ＰＣＲ条带数目和分布模式各不相同,从胶上总共回收并克隆了２１个ｃＤＮＡ片段,对其中３个做了Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交验证,有２个在彩鲫卵母细胞中特异表达,另１个在银鲫中特     

微卫星DNA分析证明异种克隆大熊猫重构胚的核来自大熊猫供体

建立了一种从早期囊胚中提取ＤＮＡ以进行核内和核外ＤＮＡ分析的方法,用这种方法从异种克隆大熊猫重构重构胚中提取总ＤＮＡ,以大熊猫特异的微卫星ＤＮＡ引物成功地扩增出了微卫星座位ｇ＾０１０,ＰＣＲ产物双向测序表明,２个重构胚与大熊猫供体对照序列完全一致。结果证明该异种大熊猫重构胚的核的确来自大熊猫供体细胞核。     

人神经元电压门控钙通道 γ -3基因的克隆

将小鼠Ｃａｃｎｇ２基因的编码区与ＥＳＴ数据库进行同源性分析,得到一个与小鼠Ｃａｃｎｇ２基因在４３５ｂｐ中有７５％同源的ＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｗ２９０９５）。在该ＥＳＴ中设计引物与ｃＤＮＡ文库载体臂上引物行巢式ＰＣＲ和ＲＡＣＥ反应,在人脑前叶皮质ｃＤＮＡ文库和人脑Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ中获得ｃＤＮＡ序列１５４５ｂｐ,其中包含一个９４８ｂｐ的可读框,编码３１５个氨基酸。该可读框经确证命名为ＣＡＣＮＧ３     

利用cDNA-RAPD技术分析籼稻光敏核不育基因的差异表达

应用混合采样法构建了光敏核不育水稻育性转换敏感期可育和不育幼穗代表群,并对其进行了ｃＤＮＡ－ＲＡＰＤ分析。结果表明：混合采样法是可行的,可以避免常规采样引起的误差。在筛选的１５０个随机引物中,有８３个随机引物扩增的条带安全相同,有３４个随机引物扩增的带型相同,但存在扩增量的差异,有３３个随机引物可在可育和不育幼穗ｃＤＮＡ 增出有差异的ｃＤＮＡ条带,多态性比率为２２％。     

人肝组织中新的C2H2型锌指蛋白编码序列的批量分离与克隆

为了探讨人肝组织中Ｃ２Ｈ２型锌脂蛋白基因的分布数目以及克隆新的锌指蛋白基因,设计了简并ＰＣＲ引物,扩增基因组ＤＮＡ,以其中的２个扩增片段为探针筛选人肝ｃＤＮＡ文库,获得了近百个阳性克隆,对其中的２０个ｃＤＮＡ片段进行了末端测序和同源检索,证明了１５个为新的锌指基因片段。对其中的４个ｃＤＮＡ片段进行了组织表达谱分析,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交显示：Ｌ５－５为肝,胰脏高度表达;其余为广谱表达。     

抗白粉病小麦-中间偃麦草(Thinopyrum intermedium,2n = 42)异附加系的选育及分子细胞遗传鉴定

利用中间偃麦草与普通小麦烟农15杂交，通过细胞学及白粉病人工接种，在杂交后代中鉴定筛选到了2个细胞学稳定的二体异附加系Ⅱ-1-7-1和Ⅱ-3-3-2，其根尖细胞染色体数为2n=44，花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ一般能形成22个二价体，与普通小麦杂交，F1PMCMⅠ一般出现1个单价体，利用白粉病15号菌种及混合菌种进行温室及田间抗病性鉴定表明它们对白粉病表现免疫，异附加系与小麦杂交F2单株染色体数及抗病性鉴定表明，抗性基因位于外源染色体上，以St和E基因组DNA为探针进行原位杂交发现，2个异附加系附加的染色体可能来自E染色体组，表明E染色体组的一对染色体携带一个新的抗白粉病基因。     

异源细胞质小麦-中间偃麦草易位系的培育与荧光原位杂交鉴定

利用提莫菲维细胞质雄性不育的小麦－中间偃麦草部分双二倍体为母本与普通小麦杂交后再与父本普通小麦连续加交和自交,在兵工中选出两个稳定的小麦类型Ｈ９６２６９－２和Ｈ９６２７８,染色体数目均为２ｎ＝４２,经接种鉴定,两个稳定类型均对条锈病有较发的抗性。以中间偃草草基因组ＤＮＡ为探针的荧光原位杂交结果表明,两个都是小麦－中间科草的小惩段层位系,易位的中间偃麦草染色体片段位于一个对小麦染本的短臂端部,遗传分     

与水稻光敏核不育性相关的cDNA片段的鉴定和染色体定位

对利用ｃＤＮＡ－ＲＡＰＤ技术获得的光敏核不育水稻可育和不育幼穗ｍＲＮＡ差异表达的ｃＤＮＡ片段进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交鉴定,获得１个与光敏核不育性相关的阳性片段ＲＰＧ４３。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交及相应的ＲＡＰＤ分析表明,ＲＰＧ４３为单拷贝序列,是转录后的加工产物。序列分析表明,ＲＰＧ４３长度为７４４ｂｐ,其中第１２６～１８５的６０个碱基与人类１１号染色体的ｐａｃ ｐＤＪ３５６ｄ６ ＤＮＡ序列有７２％的     

人脑胶质细胞瘤分化相关基因GDR1全长cDNA的克隆和鉴定

人脑胶质细胞瘤是严重危害人类健康的一类恶性肿瘤,选用在ＤＤＲＴ－ＰＣＲ研究中获得的１９个代表新基因的ＥＳＴ之一设计筛库引物,在人ＣＤＮＡＹ语文加中筛出一长度为１５３５ｂｐ的ＣＤＮＡ克隆,其开放读码框码３３４个氨基酸,与已知蛋白无明显同源性属一新发现的ＧｅｎＢａｎｋ接受号为ＡＦ０６８１９５．ＲＴ－ＰＣＲ显示该 物在分化后的ＢＴ－３２５中的表达量明显高于分化前的细胞,暗示该蛋白可能与脑     

人神经元电压门控钙通道γ-3基因的克隆

将小鼠Ｃａｃｎｇ２基因的编码区与ＥＳＴ数据库进行同源性分析，得到一个与小鼠Ｃａｃｎｇ２基因在 ４３５ ｂｐ中有 ７５％同源的 ＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋ： Ｗ２９０９５）．在该 ＥＳＴ中设计引物与 ｃＤＮＡ文库载体臂上引物行巢式 ＰＣＲ和 ＲＡＣＥ反应，在人脑前叶皮质 ｃＤＮＡ文库和人脑 Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ中获得 ｃＤＮＡ序列 １５４５ ｂｐ，其中包含一个 ９４８ ｂｐ的可读框，编码 ３１５个氨基酸．该可读框经确证命名为 ＣＡＣＮＧ３．ＣＡＣＮＧ３基因与大规模测序中定位于１６ｐ１２－ｐ１３．１的ＢＡＣ克隆ＡＣ００４１２５完全一致，从而将该基因定位于１６ｐ１２－ｐ１３．１，并由此获得它的基因组结构，编码区由４个外显子组成．经ＲＴ－ＰＣＲ分析，ＣＡＣＮＧ３在成人脑和胎脑有表达．运用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ在视网膜色素变性家系、视网膜色素变性伴耳聋和癫痫家系进行突变检测，未检测到突变．     

鮸状黄姑鱼养殖群体的遗传多样性

对Ｍｉａｎ状黄姑鱼养殖个体不同组织提取的,不同纯度及不同浓度的ＤＮＡ模板的ＲＡＰＤ扩增结果进行对照分析,在此基础上,应用２０个随机引物对其群体的遗传多样性进行ＲＡＰＤ检测。结果表明：（１）该养殖群体平均多态性为１５．３２％,平均遗传差异率为０．０３１９,遗传多样性水平较低,但仍具有一定的变异潜力,尽快采取适当的管理保护措施,可以保持乃至提高Ｍｉａｎ状黄姑鱼遗传多样性水平。（２）从不同部位（鳍鱼,肌     

应用FLUPD-DD-PCR检测血清饥饿对胶质瘤细胞mRNA表达的影响

荧光通用引物差异显示ＰＣＲ（ＦＬＵＰＤ－ＤＤ－ＰＣＲ）是以荧光通用引物和相应１０碱基随机引物进行ＤＤ－ＰＣＲ扩增,在荧光自动测序仪上进行电泳。通过对电泳图谱的分析进行特异条带的确定,使准确度和自动化程度大大提高,尤其对于表达量上有差异的ｃＤＮＡ片段,这一方法比传统的ＤＤ－ＰＣＲ更为方便。     

小鼠胸腺上皮细胞株MTEC1表达的化学趋化因子的类型分析

以自行设计的引物用ＲＴ－ＰＣＲ方法从小鼠胸腺上皮细胞株ＭＴＥＣ１的总ＲＮＡ中扩增出了ＳＤＦ－１α,ＩＰ－同和Ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎ等６种化学趋化因子的ｃＤＮＡ片段,对扩增片段进行了酸测序鉴定,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交分析结果显示;ＳＤＦ－１ｍＲＮＡ在ＭＴＥＣ１细胞株中存在两种不同的剪切形式,ＭＴＥＣ１的浓缩培养上清对小鼠胸腺ＣＤ＾４－ＣＤ＾８Ｔ细胞具有中等强度的趋化活性,符合ＳＤＦ－１的生物学功能。     

春化相关基因ver203F cDNA 3′末端的克隆及序列分析

以差异筛选技术克隆到的春化相关基因ｃＤＮＡ ｖｅｒｃ２０３为基础,设计５’端引物,利用ＲＡＣＥ克隆策略,通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增得到ｃＤＮＡ的３‘末端序列ｖｅｒ２０３Ｆ（１１９７ｂｐ）,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析表明其全长约２．０ｋｂ,且其表达具有春化处理的特异性。检索表明该基因序列（ＡＢ０１２１０３）与一大麦茉莉酸诱导基因有部分同源性,推测该基因在调控开花过程中可能参与茉莉酸介质的信号传导途径。