拟南芥微管结合蛋白MAP18通过使周质微管去稳定化参与细胞的定向生长

在细胞的生长发育过程中，微管骨架通过特定的组织和排列方式参与对细胞生长和细胞形态建成的调控，而微管在细胞中的组织和排列则主要受微管结合蛋白（microtubule associated proteins，MAPs）的控制．在植物细胞中，目前已经发现众多的微管结合蛋白，如切割微管的Katanin、稳定周质微管的MOR1、     

一种新的微管相关蛋白JWA对细胞内氨基酸平衡有重要调节作用

探讨了JWA蛋白在细胞内的确切定位、与微管蛋白的相互关系及对细胞内氨基酸平衡的调节作用. 应用4~37℃(微管解聚-聚合)交替作用法提取纯化大鼠脑组织中微管及其相关蛋白; 用免疫共沉淀法研究JWA蛋白与微管蛋白的相互作用; 应用基因转染和免疫荧光等实验方法研究低温(4℃)、秋水仙素(1 × 10^-5, 5 × 10^-5 mol/L)等处理的HBE细胞/ NIH3T3细胞中JWA和微管的动态变化及相互关系. 应用反义寡核苷酸技术结合氨基酸分析技术探讨JWA蛋白对PC12细胞内氨基酸平衡的调节作用. 结果表明, JWA蛋白是一种新的微管相关蛋白, 与微管蛋白分布基本平行, 在绝大多数情况下伴随微管动力学改变(聚合或解聚)而同步发生变化, 并且可能参与了细胞有丝分裂的过程. JWA蛋白是细胞内氨基酸总量的一种重要负性调节蛋白, 并选择性地调节细胞内谷氨酸和牛磺酸含量.     

JWA蛋白在细胞内与α-微管蛋白的共定位

探讨了JWA在细胞内的分布特征, 特别是在有丝分裂过程中的动态变化及与α-微管蛋白的关系. 用免疫共沉淀方法研究JWA与α-微管蛋白的相关性; 用基因转染技术研究JWA蛋白高表达后JWA蛋白和α-微管蛋白的相互关系; 用荧光显微镜技术研究低温处理、药物阻滞细胞周期、JWA反义寡核苷酸处理的PC12细胞JWA蛋白和α-微管蛋白的相互作用; 分别用流式细胞仪分析和激光共聚焦技术检测PC12细胞的各细胞周期蛋白在细胞内的分布. JWA作为一种新的微管相关蛋白, 在微管动力学变化过程和细胞周期不同阶段与α-微管蛋白分布平行, 可能对微管具有稳定作用.     

无微管稳定剂条件下植物微管蛋白的体外聚合

从百合花粉中提取高纯度的植物微管蛋白,建立了无微管稳定剂和微管组织中心的植物微管的体外聚合体系,并对植物微管蛋白在体外条件下的聚合特性进行了分析。结果表明,纯化的微管蛋白在体外能够很好地进行聚合,电子显微镜下可以观察到典型的微管结构,微管蛋白聚合的动力学呈现出典型的“抛物线”曲线,紫杉醇的存在改变了百合花粉微管蛋白 聚合特性,非正常微管聚合增加,体外聚合的临界浓度从无紫杉醇存在条件下的２．８ｍｇ／     

植物细胞50 ku类角蛋白与β微管蛋白共存

用选择性抽提法从悬浮培养的烟草原生质体中得到类中间纤维蛋白,免疫印迹反应显示其主要成分是分子量分别为64,58,55,54,50,45 ku的6种类角蛋白,其中50 ku蛋白与微管蛋白多抗亦有免疫交叉反应. 双向电泳显示50 ku蛋白包含两种多肽成分. 对分离纯化得到的50 ku蛋白进行部分序列测定,结果表明两种多肽成分分别为新的未知序列蛋白和β微管蛋白. 结合以往的实验结果,证明在植物中间纤维成分中,50 ku 类角蛋白与β微管蛋白相结合,可能由此介导了植物中间纤维与微管共分布.     

用整体原位杂交法研究微管蛋白基因在斑马鱼胚胎中的表达

斑马鱼是一个很好的脊椎动物发育研究模型,斑马鱼胚胎发育过程中基因表达调控的研究对揭示脊椎动物形态发生的分子机理非常重要。微管蛋白固定受精卵细胞质中的形态发生决定子,组织形成基本的细胞骨架,控制细胞的各种运动。在脊椎动物中已发现有几种微管蛋白,每种微管蛋白都有其特定的表达位点和功能。用一种β２微管蛋白基因的全长ｃＤＮＡ为模板,合成地高标记的ＲＮＡ为探针,对斑马鱼各时期的胚胎进行整体原位杂交。β２微管     

微管结合蛋白2的功能区域分析

在神经系统中,神经元作为复杂的神经网络系统中的单元,发育成一个高度极性化的形态结构.这种极性状态在它从神经母细胞开始分化长出树突和轴突时便形成,在这一过程中,微管结合蛋白(microtubule-associated proteins,MAPs)特别是MAP2与Tau蛋白的表达对于细胞的极性化形态的发生、维持及其功能等方面发挥着重要的作用.在神经突起中,MAP2可以说是树突的标记,MAP2C及tau则大量地存在于轴突中.它们靠C-末端的微管结合部位与微管结合,而N-端则突出于微管表面.用MAP2或tau转染成纤维细胞可诱导微管束的形成,进一步的实验结果表明它们都能诱导Sf9细胞长出类似于神经元的突起,并且证明了MAP2及tau的N-端,而不是C-末端分别决定神经元树突与轴突中微管之间的距离,从而确定了在轴突和树突中微管系统的结构特征.然而MAP2及tau的N-端在相     

拟南芥微管结合蛋白WDL3参与ABA诱导的气孔关闭过程

以拟南芥WDL3RNA干扰株系(WDL3RNAi)和Tubulin5A-YFP植株等为材料,从叶片的失水率、气孔开度、保卫细胞微管骨架动态排布以及Ca~(2+)流动等不同角度探究在脱落酸(abscisic acid, ABA)诱导的气孔关闭信号通路中,微管结合蛋白WDL3与微管骨架以及Ca~(2+)之间的功能关系,深入了解气孔运动机理.结果表明:(1)相同条件下,WDL3RNAi的叶片蒸腾速率明显慢于野生型.(2)气孔开度实验中,WDL3RNAi对ABA信号比野生型更敏感,气孔关闭更快;微管稳定剂紫杉醇(Paclitaxel)可部分阻碍ABA的作用,微管解聚剂黄草消(Oryzalin)则进一步促进ABA诱导的气孔关闭,但WDL3 RNAi与野生型之间仍存在显著差异;激光共聚焦扫描显微镜观察发现, ABA条件下WDL3 RNAi保卫细胞内微管解聚明显加快,微管成束程度(bundling)显著降低.(3)胞内Ca~(2+)螯合剂BAPTA与ABA共同处理,野生型和WDL3RNAi的气孔关闭均受到不同程度的抑制,关闭减缓,处理前后差异显著.亚细胞结构观察发现, BAPTA阻碍了ABA引起的保卫细胞微管解聚,但WDL3 RNAi与野生型相比,依然维持相对较高的微管解聚比例.此外,非损伤微测技术检测发现,ABA引起的保卫细胞Ca~(2+)内流在WDL3RNAi中较野生型的流速更快,流量加大,显示Ca~(2+)在该信号通路中具有重要作用.综上实验结果表明,微管结合蛋白WDL3通过与微管骨架及Ca~(2+)相互作用参与ABA诱导的气孔关闭过程.     

微管骨架与异三聚体G蛋白协同参与ABA诱导的气孔运动

以拟南芥野生型、G蛋白α亚基缺失突变体(gpa1-3,gpa1-4)及带有GFP-α-tubulin-6标记的gpa1突变体等为材料,利用药理学实验、激光共聚焦扫描显微镜观察、非损伤微测等方法研究在ABA诱导气孔运动的信息传递通路中,异三聚体G蛋白与微管骨架之间的功能关系,深入了解气孔运动机理.结果表明:gpa1突变体叶片蒸腾失水率高于野生型.气孔开度实验中,突变体对ABA抑制气孔开放作用不敏感,但微管特异性解聚剂Oryzalin在一定程度上可恢复其对ABA的响应.Ca~(2+)螯合剂BAPTA-AM与Oryzalin共同处理时,无论野生型还是突变体,ABA的作用均会被进一步削弱.激光共聚焦扫描显微镜下观察,ABA处理后,野生型保卫细胞中辐射状规则排布的微管比例急剧下降,解聚态微管大幅度增加;gpa1突变体没有出现如此明显的动态转换,仍多停滞在聚合态.ABA与BAPTA-AM共同处理,野生型植株不同微管排布类型的保卫细胞所占比例随之发生显著改变,gpa1突变体无明显变化.非损伤微测实验发现,突变体中ABA抑制光下保卫细胞Ca~(2+)外流作用不明显,但再加以微管解聚剂Oryzalin处理,Ca~(2+)外流即明显下降.以上结果显示,在G蛋白介导的ABA抑制气孔开放信号通路中,下游有保卫细胞微管骨架和Ca~(2+)的共同参与.     

细胞有丝分裂马达蛋白的化学生物学研究与展望

微管马达驱动蛋白(kinesin,简称驱动蛋白)是一类沿着微管的特定方向行走的分子马达蛋白家族,在胞内运输和细胞分裂中扮演着重要角色.为了研究驱动蛋白的时空动力学特征,过去近15年的化学生物学研究发掘了一系列特异性的小分子抑制剂,为解析驱动蛋白的系统功能提供了有效的工具.由于部分驱动蛋白在实体瘤中活性异常增高,驱动蛋白小分子抑制剂渐渐发展成为癌症化疗的先导化合物.事实上,基于驱动蛋白Eg5(也叫KIF11)和CENP-E(着丝粒结合蛋白E)的小分子抑制剂已经进入Ⅰ期和Ⅱ期临床实验.本文将简介驱动蛋白的小分子抑制剂研究进展及临床转化研究前景.     

间期染色质形成微管的条件

在分离的间期细胞核群体中,除完整的核外总夹有一些核膜破裂的核。利用这个事实,如果将分离的间期核与微管蛋白溶液混和并使此混合液中的微管蛋白聚合的话,我们可能探知在间期核内是否具有微管组织中心(MTOC),以及核膜在微管的形成中是否起作用。基于这一简单的想法,我们做了本文内的一些实验。     

微管解聚驱动蛋白Kinesin-13的研究进展与展望

微管是细胞骨架的重要组成成分,其在细胞内的动态调节关系着细胞正常生理功能的发挥和维持.目前发现多种参与细胞内微管组装与解聚调控的蛋白,其中发挥微管解聚功能的Kinesin-13驱动蛋白家族被广泛地研究,该蛋白具有控制有丝分裂,调控纤毛组装与解聚和神经轴突发育与修复等功能.本文主要对Kinesin-13微管解聚机制,以及在主要的模式生物中生物学功能与调控机制进行比较与分析.     

高等生物细胞微管蛋白的区域与染色体微管的形成

在有丝分裂及减数分裂时纺锤体包含两组微管,即染色体微管或称动点微管和极间微管(或称极至极微管)。在纺锤体发生的后阶段动点微管的装配是一个基本和重要的过程。在高等生物细胞内,已知纺锤丝附着点(简称着丝点)(SFAs)作为微管组织中心在此过程内起着主要的作用。在有丝及减数分裂时远在核膜破裂之前,SFAs就可以从形态上识别出来。然而虽在整个细胞周期中细胞内均含有大量的微管蛋白,但却从未在这些生物细胞核内发现过任     

微丝、微管抑制剂及周期性电脉冲对豌豆幼苗韧皮部运输的影响

<正>高等植物韧皮部运输是否只靠源库间的膨压差来推动,其中有无原生质的参加,一直是有争议的问题.60年代初,阎隆飞等首先在烟草韧皮部鉴定出肌动球蛋白.阎隆飞和刘国琴最近又在芹菜韧皮部鉴定出微管蛋白和类动蛋白(kinesin-like protein).过去对韧皮部蛋白(P-蛋白)能否执行运输功能颇有争议,最近也在其中找到了与运动有关的蛋白质,这引起研究运输的生理学家的极大兴趣.微丝、微管是高等植物细胞的基本组分.在丝瓜卷须快速弯曲运动中,接受刺激的部位与发生快速运动的部位之间需要有电波传递,电波所到之处,原生质发生收缩运动.已经在丝瓜卷须中鉴定出肌动蛋白和肌球蛋白.用专一性抑制剂的研究也表明,发生收缩运动的组分是微丝.表明植物原生质的运动与动物类似,受“神经-肌肉机制”的调控.Wayne的研究表明,细胞内的电波传递会干扰肌动蛋白和肌球蛋白相互作用,使胞质环流停止.我们最近的研究结果表明,周期性电脉冲减弱玉米苗韧皮部对¹⁴C-同化物的运输,但并不影响³²P在木质部的运输,提示电脉冲刺激很可能是作用于韧皮部的微丝、微管 因此,我们设想运输韧皮部(transport phloem)筛管中微丝和微管的生理活动参与韧皮部运输.本试验利用微丝、微管特异抑制剂和周期性电脉冲抑制微丝和微管的生理活动,进而观察其对抑制韧皮部运输的效应.正在萌发的豌豆幼苗,适于用作细胞内含物再分配的研究. 营养源是养料储备丰富的子叶,胚根维管束是物质运输的通道,正在伸长生长的胚根是库,构成理想的源、库、通道的物质运输系统.在这个系统中,胚根伸长生长所需的物质完全靠子叶细胞内含物的再分配,这和蒜苔细胞内含物向新生珠蒜的再分配很相似.蒜瓣表皮和蒜苔组织汁液的转移主要靠原生质的胞间运动,但韧皮部的汁液运输有无原生质的推动至今尚未阐明.本试验以豌豆胚根的伸长生长和外源¹⁴C-蔗糖作为作韧皮部汁液运输的指标,从两个角度考察微丝、微管在韧皮部运输中的作用:即分别观察微丝、微管抑制剂和周期性电脉冲刺激对韧皮部运输的影响.     

生命中的物理学

正从群聚的鸟儿到蜂拥的分子,物理学家们正在试图理解"活性物"——寻找我们所在的这个世界的基本理论。首先,兹沃尼米尔·多吉克(Zvonimir Dogic)与他的学生们采用了微管(这是一种线状的蛋白质,构成了细胞内部的"细胞骨架"),将它们与驱动蛋白混合,驱动蛋白是一种马达蛋白,像铁轨上的火车一样沿着这些微管移动。接着,研究者让这种混合物液珠悬浮在油里,再提供上被人称为"三磷酸     

fibrillarin在有丝分裂过程中分布于纺锤体两极

fibrillarin是核仁的一个主要蛋白成分，细胞分裂时它要经历从核仁到细胞质的重新分布过程，并且与细胞分裂后核仁的重新组装有着密切的关系。为了研究有丝分裂过程中fibrillarin的动态变化及与其他细胞结构的关系，构建了fibrillarin的真核表达载体，采用cDNA转染，免疫荧光标记和免疫共沉淀等方法证明了处于分裂期的HeLa细胞中fibrillarin不但分布于细胞质，而且还有一部分定位于纺锤体两极的中心体部位，并且与与NuMA蛋白共定位，当使用药物将分裂期细胞的微管结构解聚后，fibrillarin在两极聚集的现象消失，而后随着纺锤体的重新组装，fibrillarin又在两极重新出现，体外非细胞体系的实验也证明了fibrillarin和分裂期细胞中微管中心体结构结合在一起。     

植物细胞50ku类角蛋白与β微管蛋白共存

用选择性抽是法从悬浮培养的烟草原生质体中得到类中间纤维蛋白,免疫印迹反应显示其主要成分是分子量分别为６４,５８,５５,５４,５０,４５ｋｕ的６种类角蛋白,其中５０ｋｕ蛋白与微管蛋白多抗亦有免疫交叉反应。     

一种新的中心体常驻蛋白的鉴定

利用膜特异结合抗体洗脱法,用一例自身免疫病人血清鉴定了一种新的中心体蛋白３１／２９抗原。免疫荧光结果显示这种抗原定位于中心体处,不依赖于细胞周期的变化,属于一种中心体常驻蛋白。为了研究细胞核周期与中心体复制之间的协调关系,利用此抗血清以及Ｃｅｎｔｒｉｎ和γ－微管蛋白（γ－ｔｕｂｕｌｉｎ）抗体研究了Ｖ７９－８细胞在人工诱导产生早熟染色体凝集（ＰＣＣ）现象时其中心体复制周期的变化。结果发现在羟基脲抑制     

神经再生过程中脊髓运动神经元β和γ肌动蛋白的基因表达

神经细胞的特点之一是轴突缺乏合成蛋白的能力,轴突生长发育、代谢更新以及损伤后再生中所需的结构和功能物质必须在神经元胞体内合成,经轴浆转运供应.细胞骨架是轴突构筑的重要组分,其主要组分之一的微管又是转运物质的载体.我们曾经报道再生神经中微管亚基管蛋白的含量和转运速度以及腹角运动神经元中管蛋白mRNA的含量均明显增高,从而满足轴突构筑重建的需要.由于作为细胞骨架的微丝其亚基肌动蛋白的含量在再生神经中也有增加,而肌动蛋白又可能有转运轴浆中小泡的功能,但尚未见再生过程中脊     

PP4低表达对人乳腺癌细胞MCF7增殖的影响

蛋白磷酸酶4 (protein phosphatase 4, PP4)在果蝇、线虫及哺乳动物细胞中都可定位于中心体上, 且在果蝇和线虫中参与了中心体成熟. 为探讨PP4在哺乳动物细胞中的功能, 通过RT-PCR的方法扩增得到PP4基因全长序列, 构建pEGFP-C1-PP4融合蛋白表达质粒. 将该质粒转染MCF7细胞, 用间接免疫荧光技术确认PP4在MCF7细胞中的中心体定位. 将PP4蛋白中非磷酸酶保守区序列作为反义抑制作用的靶序列, 构建真核表达重组质粒pXJ41-as-PP4并转染MCF7细胞, G418筛选获得稳定的PP4表达受抑制的细胞株MCF7pXJ41-as-PP4. 对此细胞株进行细胞形态、骨架结构、生长特性及有丝分裂过程观察分析, 发现其生长速率明显减慢, 血清依赖性增强, TdR双阻断进行周期同步化结合流式细胞术以及有丝分裂指数分析发现细胞进入M期受阻. 间接免疫荧光检测发现, 细胞中微管组织紊乱, 细胞核物质增加, 细胞群体中多核细胞比例增加, 有丝分裂过程发生异常, 出现较多多极分裂现象. 这些结果表明, 在哺乳动物细胞中, PP4的正常表达对中心体正常行使微管组织功能是必要的, 抑制PP4表达将导致细胞增殖及周期进程发生异常.