末端限制性酶切片段长度多态性分析技术进展

末端限制性酶切片段长度多态性分析(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism,T-RFLP)是近年来发展起来的、不依赖于培养的微生物群落分析方法之一.由于其在微生物群落结构分析方面的特点,包括分辨率高、易于实现自动化及互联网海量数据共享等优势,自1997年最先被报道以来得到了广泛的应用,成为环境微生物群落分析的最强有力的工具之一.类似于其他的分子微生物生态学技术,T-RFLP也有自身的缺陷,本文详细介绍了T-RFLP技术的原理及其解析环境微生物群落的基本流程,简述了近年来T-RFLP技术在群落分析中的研究进展,重点讨论了该技术的局限性及相应的解决办法.     

50例中国人IX因子基因的限制性片段长度多态性

用IX因子基因内探针F9(VⅢ)对TaqI,BamHI和EcoRI酶切的50例中国人基因组DNA进行杂交分析。结果表明,所有个体经TaqI酶切的杂交片段为4.5kb和1.8kb,BamHI和EcoRI酶切的杂交片段分别为23kb和5.0 kb。基因组DNA样本中未发现限制性片段长度多态性(RFLP),这与欧美国家的民族群体中存在着IX因子基因内TaqI和BamHI的RFLP的结论不同。造成不同种族间DNA水平差异的原因,很可能与长期在不同地理环境中的进化适应有关。     

利用扩增片断长度多态性技术分析长江刀鲚的遗传多样性

利用AFLP技术对我国长汀南京潜州江段捕获的野生刀鲚(Coilia nasus)资源的遗传多样性进行了分析.筛选出扩增片段多、条带清晰的3对EcoR I/Mse I引物组合,在34尾个体中共扩增出118条清晰的片段,分子量大小在200～1500bp之间,其中多态位点67个,多态性比例为56.78%.种群Nei基因多样性指数为0.2183,Shannon多样性指数为0.3204;种群内遗传距离在0.1263～0.4012之间,显示目前长江刀鲚野生群体的遗传多样性比较丰富.     

16S rRNA基因技术在油藏微生物生态研究中的应用

分子生态学技术的发展大大促进了人们对环境中微生物群落的研究，也为研究油藏微生物群落和微生物采油技术提供了一个新的工具，尤其16S rRNA基因技术应用于油藏微生物生态研究．该技术克服了基于细胞水平研究方法的不足，能更准确、更客观地揭示油藏微生物的多样性、群落动态变化、种群结构及进化等方面的信息．文章简要综述了16S rRNA基因技术发展历程及在环境微生物生态学中的应用，详细概述了16S rRNA基因技术在油藏微生物生态研究中的地位和作用以及用于油藏微生物生态研究的16S rRNA基因技术，讨论了16S rRNA基因技术目前在油藏微生物生态研究中存在的问题，通过实例论证了该技术的现场应用效果，重点介绍了胜利油田利用T-RFLP、DGGE等分子生态学技术在河口采油厂罗801区块空气辅助微生物驱和单12区块内源微生物驱研究中的应用，阐明了分子生态学技术在微生物提高原油采收率研究中的重要的意义．     

用dystrophin cDNA1－7的三个亚探针检出四个新的TaqⅠ限制性片段长度多态

报道在ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ基因内新发现四个ＴａｑⅠ限制性片段长度多态，用ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎｃＤＮＡ１—２ａ检测到的ＴａｑⅠ等位片段是４．０ｋｂ（Ａ１）和３．３ｋｂ（Ａ２），用ＣＤＮＡ２ｂ—３检测到的ＴａｑⅠ等位片段是７．２ｋｂ（Ａ１）和６．８ｋｂ（Ａ２）。用ｃＤＮＡ５ｂ—７检测到两对新的ＴａｑⅠ等位片段，分别是１０．０ｋｂ（Ａ１）和８．４ｋｂ（Ａ２），以及２．５５ｋｂ（Ｃ１）和１．６ｋｂ（Ｃ２）片段。在４５个ＤＭＤ／ＢＭＤ家系的基因检测中，这四对新的等位片段，在部分家系的上下代传递中分别呈孟德尔遗传学分离。它们的实际观察杂合体频率依次是：０．２９，０．０７，０．０４和０．１８，预期杂合体频率是０．２０，０．０６，０．０２和０．２０。这些新的ＴａｑⅠ限制性片段长度多态，已在杜氏肌营养不良症家系的遗传连锁分析及致病基因携带者的诊断中，显示出较高的；临床应用价值。     

甘肃回汉族人群D1S80位点扩增片段长度多态性研究

报道了对甘肃省108名汉族和72名回族无关个体D1S80位点扩增片段长度多态性的等位基因频率调查分析,已在汉族中发现21个等位基因,71种基因型,基因频率为0．005－0．111,杂合度为82％,个体识别率为0．95,在回族人群中发现22个等位基因,51种基因型,基因频率为0．007－0．153,杂合度为86％,杂合度为86％,个体识别率为0．92,基因频率符合Hardy-Weinberg法则,结果提示甘肃省回族和汉族之间在其等位基因数目及频率分布上均存在显著性差异,进一步的分析还表明甘肃省汉族人属于北方群体,支持了有关中国大陆存在南北两大群体的观点。     

籼稻品种地谷抗稻瘟病基因的遗传分析和定位

利用我国稻区的稻瘟病生理小种ZB₁₃和ZB₁₅对地谷与感病品种江南香糯的杂交F₁,F₂和B₁F₁群体进行接种鉴定,确认地谷对ZB₁₃和ZB₁₅的抗性受一对显性基因控制．应用ZB₁₃接种的(地谷×江南香糯)F₂群体构建抗病池和感病池,通过RFLP和微卫星标记对两池DNA多态性的检测,发现两个可能与相应抗病基因紧密连锁的分子标记．进一步用F₂分离群体,将该基因定位于第2染色体,暂定名为Pi-d(t)．     

蚯蚓粪中微生物群落特征分析

宏基因组学技术是研究特定环境微生物的重要手段之一.笔者利用ITS和16S rRNA高通量测序技术,对蚯蚓粪中真菌和细菌群落结构特征进行系统分析.结果发现,207 331序列共获得11 951 OTUs,细菌和真菌分别为10 218,1 733 OTUs.细菌群落检测到34个菌门,优势菌门为变性菌门,其次为拟杆菌门、酸杆菌门、放线菌门和浮霉菌门.优势菌目为浮霉状菌目、根瘤菌目和噬纤维菌目.真菌群落检测到9个门,优势门为罗兹菌门和子囊菌门,优势目为粪壳菌目.在属水平上检测到大量的有益生防真菌和生防细菌.该研究结果为进一步开发利用蚯蚓粪微生物资源、探索其在植物土传病害生物防治方面的作用提供理论基础.     

分子生物学技术在微生物多样性研究中的应用

用传统的方法很难鉴别微生物的差异,分子生物学技术就很好地解决了该问题,尤其适合于常规方法失效的情况下.该技术的主要程序是:先从微生物中直接提取DNA,对DNA进行PCR(PolymericChain Reaction)或RAPD(Random Amplification of Polymorphic DNA)扩增,然后进行DGGE(DenaturingGradient Get Electrophoresis)电泳,或RFLP(Restriction Fragment Lergth Polymorphism),ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assav)分析等,之后进行测序,测序结果与网上基因库进行对比,来确定样品中微生物的种类.此方法是直接从样品中提取总DNA,中间不会造成菌株的富集或衰减,具有很高的准确性.此方法对微生物多样性的深入研究很有效.     

广东汉族人群LDL受体基因PvuⅡ多态性位点的研究

建立了ＬＤＬ受体基因内含子１５ｐｖｕⅡ多态性位点的ＰＣＲ－ＲＦＬＰ技术．利用该技术从人类外周血基因组ＤＮＡ中分离到一个长为０．８１ｋｂ的片段,核酸序列测定证明分离的片段是ＬＤＬ受体基因内含子１５．对广东汉族人群内含子１５的ＰｖｕⅡ位点多态性状况进行了研究,实验显示：广东汉族人群ＬＤＬ受体基因中存在着ＰｖｕⅡ多态性位点;２１２个ＬＤＬ受体等位基因ＰｖｕⅡ酶切位点出现的频率为０．１６,说明ＰｖｕⅡ多态性位点可以作为广东人群的遗传标记．     

鹀科8种鸟类遗传多样性及亲缘关系的AFLP分析

应用扩增片段长度多态性(AFLP)技术研究鹀科8种28只鸟类的亲缘关系及遗传多样性. 28只个体分为两类, A类包括所有鹀属鸟类, B类包括铁爪鹀属和雪鹀属的铁爪鹀和雪鹀. 将A和B类中的不同物种分为不同分支: 栗斑腹鹀与三道眉草鹀和白头鹀为一支, 芦鹀、 红颈苇鹀和苇鹀为一支, 结果表明它们之间具有较近的亲缘关系. 其中雪鹀和铁爪鹀位于分支的最底部, 支持了其应从鹀属中分离的观点.     

窖泥微生物群落SSCP分析条件优化的研究

由于窖泥微生物群落结构复杂,而PCR-SSCP是研究环境微生物群落较理想的一种方法。试验对影响SSCP图谱的条件进行优化分析,为窖泥微生物群落结构解析提供了有效的手段。结果表明:变性缓冲液配比为:去离子甲酰胺1.9mL、溴酚蓝3mg、5×TBE 250μL、0.5M EDTA5μL、10%SDS5μL;凝胶条件为:凝胶浓度为12%、丙烯酰胺与N,N′-亚甲基双丙烯酰胺的比例为29∶1、无甘油。经95℃变性10min,4℃条件下200V电泳8h,可得到较理想的图谱。     

鄱阳湖流域底泥微生物对环境变量的响应

以鄱阳湖流域4个支流共6个地点(信江XS1、信江下水湾XS3、饶河RS、饶河内湖RHS、修水SS、赣江GS)的底泥样品为研究对象,利用16 S rRNA基因扩增技术探究底泥微生物对环境变量的响应.结果显示:6个采样点的底泥样品的微生物群落结构大致分为4类; 底泥的pH值、TOC、TN、TP和重金属含量对微生物群落结构及微生物多样性存在着显著的影响.4条河流底泥微生物多样性指数顺序为赣江>信江>修水>饶河,同时发现饶河的Cu、Zn含量在4条河流中最高,这说明高Cu、Zn会对微生物多样性产生负面的影响; 河流与其所对应湖区底泥样品中微生物多样性指数比较发现:饶河>饶河内湖,信江下水湾>信江,这种结果顺序的不一致主要是由底泥中营养物质含量不同和某些重金属元素胁迫导致的.     

极端干旱区包气带异养微生物16S rDNA的多样性

在黑河流域下游河谷550 cm深的包气带中采集了10个土壤样品,相应地对各个样品中的土壤含水量、总氮、土壤有机质和pH值进行了采样分析,并进行了微生物计数和培养.通过培养,从不同的培养基和不同土壤层,共挑选出120个菌落,然后使用革兰氏染色反应、常规生理生化和内切酶分析,再选出不同的15个菌落进行16S rDNA扩增和序列测定,共发现15种细菌,并建立了可培养微生物的系统进化树.这15个种分别属于蛋白细菌门的α-(2种),γ-(2种)和β-(2种)组,高G C的革兰氏阳性菌(5种),低G C的革兰氏阳性菌(2种)和Cytophaga-Flexibacter-Bacteroides细菌(2种),这些种群全部属于棒状或段棒状,表现出明显的多样性.结果表明:地下土壤的物理和地球化学特征的不同影响地下微生物的种群数量,该研究为极端干旱区地下微生物生态学和水文地质以及相互作用提供了一个非常有意义的窗口.     

锰污染稻田土壤微生物群落结构和遗传多样性研究

采集了湖南省湘潭市锰矿尾渣坝附近受不同程度锰污染的7个水稻田土壤样品,总锰浓度范围为114~4611mg/kg.提取土壤细菌总DNA,用通用引物对其中的16SrDNA进行扩增,然后进行变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis),分析长期受锰污染的水稻田土壤微生物群落结构和遗传多样性变化,存在于污染最严重样点中的细菌种群对锰有较高的耐受性,不同锰污染的样点群落结构发生变化并且有菌种的消亡和新菌种的产生.锰污染直接和间接地改变了水稻田土壤微生物群落结构和遗传多样性.     

俄罗斯卡尔梅克共和国传统奶酪中细菌多样性研究

俄罗斯传统奶酪生产历史悠久、工艺独特,其中蕴含着丰富的微生物。本研究采用454焦磷酸测序技术对俄罗斯卡尔梅克共和国的6份传统奶酪进行分析。结果表明,6份样品共鉴定出7个细菌门、50个细菌属。优势菌门为硬壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria),优势菌属以乳球菌属(Lactococcus)和链球菌属(Streptococcus)为主,但R5号样品的优势菌属为柠檬酸杆菌属(Citrobacter)和不动杆菌属(Acinetobacter)。个别样品中检测到了含量较低的有害微生物如漫游球菌属(Vagococcus)和克雷伯氏菌属(Klebsiella)等。通过主坐标分析发现,采自同一地区的R1-R4号样品在菌群结构上较为接近,因此初步判断地理区域因素可能是影响传统奶酪中细菌构成的重要因素。     

种植黑麦草对山西工矿区多环芳烃和重金属复合污染土壤微生物群落多样性的影响

本文以山西工矿区生黄土为供试土壤,以黑麦草(Lolium perenne L.)为供试植物材料,通过室内培养实验,采用变性梯度凝胶电泳技术(DGGE),研究不同浓度PAHs和HgCl2单一及复合污染种植黑麦草对土壤微生物群落多样性的影响.结果表明:不同浓度PAHs与HgCl2处理下黑麦草土壤微生物基因条带差异明显.与对照组相比,低浓度污染处理下基因条带数稍有增加,而高浓度污染处理下部分基因条带消失.各污染水平下土壤微生物所共有的优势条带较多.在HgCl2单一污染条件下,土壤微生物多样性首先随着污染浓度的升高而增加,污染浓度大于3 mg·kg-1时,土壤微生物群落多样性指数随着浓度的升高逐渐降低,在最高浓度60 mg·kg-1时,较对照组降低5.0%;PAHs单一污染与HgCl2单一污染处理下土壤微生物群落多样性指数表现出相似的规律,污染浓度大于10 mg·kg-1时,土壤微生物群落多样性指数开始降低,在最高浓度50 mg·kg-1时,较对照组降低了2.8%.HgCl2与PAHs复合污染在中浓度A22(PAHs 5 mg·kg-1、HgCl215 mg·kg-1)时对土壤微生物群落多样性表现为协同作用,而在最高浓度A36(PAHs 50mg·kg-1、HgCl260mg·kg-1)则表现为抑制作用.     

中国明对虾与5种虾类线粒体16S rRNA和COI基因片段的序列比较及其系统学初步研究

采用PCR扩增和序列测定等技术,对中国明对虾（Fennerpenaeus chinem如）线粒体DNA16S rRNA和细胞色素氧化酶I（COI）基因片段进行了初步研究,分别得到16S rRNA和COI 2个基因片段的碱基序列,其中16S rRNA基因片段的大小为515bp,碱基A＋T,G＋C的组成分别为66．47％和33．53％;COI基因片段的大小为472bp,碱基A＋T,G＋C的组成分别为62．50％和37．29％．在2种基因片段中,AT的组成明显高于GC的组成,这与果蝇、虾类、蟹类等无脊椎动物的16S rRNA和COI基因片段的研究结果相似．通过对中国明对虾16S rRNA和COI 2个基因片段遗传特征的研究,16S rRNA只有8处核苷酸的碱基在4个群体间表现出差异,COI基因片段中共检测出24个多态性核苷酸位点,其种内变异较低。另外,将本研究所得序列与GenBank中对虾科5个种的16S rRNA基因片段序列进行比较后,发现其聚类关系与传统分类相一致．     

AVMCD:基于16SrRNA测序的微生物群落 多样性分析与可视化平台

传统的技术手段已逐渐难以适应现代生物技术的发展,随着以16S rRNA为代表的第二代高通量测序技术飞速发展,微生物群落多样性研究已进入分子时代,但要分析庞大的测序数据并从中找寻存在的关联还是给生物学家带来诸多现实困难.为帮助研究者更快更好地掌握微生物群落多样性的信息,开发了AVMCD(analysis and visualization of microbial community datasets)生物信息平台,提供基于16S rRNA测序的专业在线分析及可视化服务.AVMCD坚持友好快捷的交互方式,注册用户只需上传待分析的数据,根据提示简单设置参数,即可由平台自动展开专业的序列分析,并将结果以丰富的可视化形式呈现给用户.     

地下水原位修复过程中微生物群落结构的变迁

针对主要受三氯乙烯（TCE）和二氯乙烯（DCE）污染的地下水,将复合药剂注入地下,在缺氧/厌氧条件下,经30 d的修复,可以使TCE完全去除,同时使DCE浓度降至风险控制值以下.注药前,地下水中变形菌门（Proteobacteria）的相对丰度高达95.44%.注入复合药剂后,厚壁菌门（Firmicutes）的相对丰度增至53.45%.同时,具有TCE和DCE降解功能的梭菌属（Clostridium）和毛球菌属（Trichococcus）在复合药剂的刺激下富集,其相对丰度从0分别增加到35.17%和14.00%,成为了新的优势菌属,使受污染的地下水得到有效修复.热图分析表明,复合药剂对TCE和DCE降解微生物的生长繁殖起到了促进作用.通过分析地下水中微生物群落结构的变化可以间接评估地下水的修复效果.