大豆中NBS类抗病基因同源序列的分离与鉴定

植物抗病原克隆研究对于植物抗病育种和抗病机制的理解具有重要意义。根据预测结构域可将已知植物抗病基因分为4类,其中以NBS（nucleotide binding site)结构域为主。NBS结构域包括P环（激酶1a)、激酶2a和激酶3a。这为利用同源技术克隆植物抗病基因提供了可能。根据烟草抗花叶病毒N基因和拟南芥抗丁香假单孢杆菌RPS2基因设计兼并引物,从大豆抗花叶病毒品种科丰1号的基因组中扩增获得358个克隆,鉴定出4个能读的且与抗病基因NBS结构域同源的片段：KNBS1,KNBS2,KNBS3和KNBS4.Southern杂交表明NBS类抗病基因在大豆中为多拷贝家族;RFLP分析将KNBS4定位于F连锁群,而NBS2则与大豆抗花叶病毒基因Rsa的SCAR标记同位于J连锁群。Northern分析表明KNBS2类在大豆的根、茎和叶中为低丰度组成型表达,这为最终克隆大豆抗病基因打下了基础。     

水稻不完全隐性卷叶主基因以rl（t）的精细定位

利用奇妙香（QMX）为轮回亲本，与卷叶珍汕97B（JZB）杂交并回交的BC4F2和BC4F3两群体为研究材料，对卷叶性状进行了遗传分析，并对卷叶基因进行精细定位．遗传分析表明，卷叶性状主要受1对不完全隐性主基因的控制，命名为rl（t），并同时受到数量性状基因和或环境的影响．利用500个SSR标记和新开发的15个InDel标记，通过BSA法在卷叶DNA池和平展叶DNA池间筛选到8个多态性标记，并用MAPMAKER／EXP3．0构建遗传连锁图．基因定位方法采用复合区间作图法（CIM）．利用BC4F2分离群体将rl（t）初步定位于第2染色体长臂，位于标记InDel 112-RM3763之间，两标记之间的遗传距离为2．4cM，rl（t）距离InDel 112约1．0cM．为精细定位rl（t），从BC4F2代经标记选择得到1个中度卷叶植株，自交扩繁成855株个体的BC4F3代株系，另发展4个新的InDel标记．连锁分析表明，InDel 112．6和InDel 113位于标记InDel 112和RM3763之间．利用BC4F3株系中分离出的191个卷叶株和185个平展叶株，将rl（t）定位于InDel 112、6-InDel113之间，物理距离为137kb、对该区段进行了初步的侯选基因分析，推测rl（t）可能参与了microRNA（miRNA）系统对叶片发育的调控．     

玉米抗纹枯病QTL分子标记定位

用抗玉米纹枯病自交系CML270和感病自交系478的(CML270×478)×CML270 BC_1∶2群体共322个株系为作图和定位群体, 构建了125个SSR标记位点的遗传连锁图谱, 覆盖玉米基因组1939.0 cM, 平均图距15.5 cM. 采用复合区间定位分析, 检测到玉米纹枯病抗病指数主效QTL位点3个, 2个位于第1染色体, 1个位于第7染色体上, 它们分别能解释表型变异的18%~20%; 控制株高的QTL位点7个, 分别位于第3~6染色体上, 控制“穗位高”的QTL位点5个, 分别位于第3, 4, 6染色体上. 自交系CML270玉米纹枯病抗性主效QTL真实存在, 抗性与植株高度遗传上不存在连锁关系, 为玉米纹枯病分子标记辅助选择(MAS)和抗性基因分离与克隆提供了技术和材料支撑.     

玉米大斑病抗性基因Ht2的精细定位

精细定位玉米大斑病抗性基因Ht2对于图位克隆该基因和探讨玉米基因组中抗病基因的分布规律及分子标记辅助选择有重要意义。以大斑病的感病自交系“获白”为母本，抗病自交系“77Ht2”为父本，构建了F2作图群体。通过RFLP分析知，Ht2基因定位在第8染色体的UMC89和BNL2．369之间，与BNL2．369相距0．9cM。然后选用在该区域的SSR标记进行了加锁分析，确定了SSR标记UMC1202，BNLG1152，UMC1149与Ht2基因紧密连锁，其中UMC1149与Ht2基因的距离为7．2cM。利用BSA法从450个RAPD引物的扩增产物中筛选出7个可能与Ht2基因连锁的标记，并将其中单拷贝标记转换为SCAR标记。连锁分析表明，一个SCAR标记（定名为SD－06633）距Ht2基因0．4cM。在此基础上，构建了Ht2基因所在区域的分子标记连锁图。     

大豆对灰斑病菌7号小种抗性的遗传分析及抗病基因的RAPD标记

对杂交组合东农91212（感7号小种）×东农9674（抗所有小种）的抗性分析表明,大豆对7号小种的抗性受单显性基因控制。运用BSA法筛选到3个与抗病基因连锁的RAPD标记。其中引物OPSO3扩增的2个标记OPSO3_(620)和OPSO3_(580)具有共显性的分离特点。OPSO3_（620）与抗病基因的遗传距离为8.7cM。根据该标记选择基因型纯合和杂合的抗病植株,其符合率分别达到100％和97.6％。     

多基因聚合改良杂交稻恢复系福恢676的稻瘟病抗性

福恢676是一个综合性状优良但稻瘟病抗性不强的杂交水稻恢复系,该父本已测配育成的18个杂交稻品种通过了省级以上品种审定.为了改良其稻瘟病抗性,延长该恢复系在生产上的应用期限.以携带3个稻瘟病抗性基因(Pi-1、Pi-9和Pi-k^h)的优质恢复系金恢1059为供体亲本,以福恢676为轮回亲本,通过回交导入、分子标记辅助选择及田间稻瘟病抗性鉴定相结合的方法,选育出5个抗病的稳定株系,其中3个株系聚合了Pi-1、Pi-9和Pi-kh.对这5个株系的综合农艺性状、品质和配合力等进行系统比较,并结合稻瘟病抗性鉴定.结果表明,与福恢676相比,改良株系及其与广8A、荃9311A和广占63-4S等不育系配制的杂种F1均表现出稻瘟病抗性明显增强,而其中株系6综合表现最优,遗传背景恢复率为97.1%,且其生育期、株高等主要农艺性状与福恢676测配组合无显著差异,但产量有所提高,品质得到改善.改良的株系6保留了福恢676产量高、恢复力强、配合力好等优良特点,品质有所提升,具有较好的应用前景.     

抗小麦黄花叶病毒转基因小麦的获得及病毒诱导的基因沉默

利用Act1启动子和除草剂选择标记bar基因，构建了含有小麦黄花叶病毒外壳蛋白基因的植物表达载体，采用基因枪法导和小麦品系，经PCR和PCR－RFLP对转基因小麦T0代及T1代进行检测后，对阳性植株的后代株系（T2代）进行田间抗病性检测。结果表明，外源基因可以在后代中遗传，并且其中一个转基因株系的后代(P8-T2)对小麦黄花叶病毒呈现高度抗性，经Westernblot和RT－PCR检测发现，抗病转基因小麦体内外壳蛋白基因在病毒感染后的表达水平出现明显下降，认为所获得转基因小麦的抗性是由病毒诱导的基因沉默引起的。     

聚合酶链式反应(PCR)用于地中海贫血的产前诊断

DNA分析已成为诊断许多遗传疾病选用的方法。1978年发现DNA的限制性片段长度多态性(RFLP)与镰刀形贫血病基因(Hb s)连锁不平衡现象,成功地对有Hb s风险的胎儿进行了产前诊断。此后,RFLP作为基因的遗传标记广泛应用于基因的连锁分析和遗传疾病的诊断。1983年建立的寡核苷酸探针检测基因突变的技术,可     

水稻不完全隐性卷叶主基因rl(t)的精细定位

利用奇妙香(QMX)为轮回亲本, 与卷叶珍汕97B(JZB)杂交并回交的BC₄F₂和BC₄F₃两群体为研究材料, 对卷叶性状进行了遗传分析, 并对卷叶基因进行精细定位. 遗传分析表明, 卷叶性状主要受1对不完全隐性主基因的控制, 命名为rl_(t), 并同时受到数量性状基因和或环境的影响. 利用500个SSR标记和新开发的15个InDel标记, 通过BSA法在卷叶DNA池和平展叶DNA池间筛选到8个多态性标记, 并用MAPMAKER/EXP3.0构建遗传连锁图. 基因定位方法采用复合区间作图法(CIM). 利用BC₄F₂分离群体将rl_(t)初步定位于第2染色体长臂, 位于标记InDel 112~RM3763之间, 两标记之间的遗传距离为2.4 cM, rl_(t)距离InDel 112约1.0 cM. 为精细定位rl_(t), 从BC₄F₂代经标记选择得到1个中度卷叶植株, 自交扩繁成855株个体的BC₄F₃代株系, 另发展4个新的InDel标记. 连锁分析表明, InDel 112.6和InDel 113位于标记InDel 112和RM 3763之间. 利用BC4F3株系中分离出的191个卷叶株和185个平展叶株, 将rl_(t)定位于InDel 112.6~InDel 113之间, 物理距离为137 kb. 对该区段进行了初步的侯选基因分析, 推测rl_(t)可能参与了microRNA(miRNA)系统对叶片发育的调控.     

两个来源于野生稻的抗褐飞虱新基因的分子标记定位

选用抗源来自药用野生稻（Oryza offcinalis Wall)的抗褐飞虱品系B5为父本,与感虫品种台中本地1号（TN1）杂交,随机选取167个F2单株构成定位群体。运用RFLP技术,采用集团分离分析法（bulked segregant analysis,BSA),对水稻抗褐飞虱基因进行分子标记定位。于第3和第4染色体找到与抗褐飞虱基因连锁的RFLP标记。构建了连锁标记附近区域的RFLP遗传连锁图谱,对这两个抗位点进行了QTL（quantitative trait locus)分析,将这两个抗褐飞虱基因分别定位于第3染色体的G1318和R1925,第4染色体的C820和S11182之间。与已报道的水稻抗褐飞虱基因位点相比较,表明这两个抗褐飞虱基因是新的抗性位点。抗褐飞虱基因新位点的发现和分子标记的建立,为水稻抗虫分子标记辅助育种和抗褐飞虱基因克隆打下了良好基础。     

水稻含隐性抗白叶枯病基因xa5的24kb片段的鉴定与基因预测

水稻xa5基因是具有重要研究和育种价值的隐性广谱抗白叶枯病基因.利用水稻品系IR24及其近等基因系IRBB5(含xa5基因)杂交组合,构建了含4892个单株的F2定位群体.同时,利用与xa5连锁的RFLP标记筛查含xa5基因的水稻抗性品系IRBB56的BAC文库,构建了一个覆盖目标基因位点的长约213kb的跨叠克隆群.根据国际水稻基因组和中国超级杂交稻基因组序列,以及跨叠克隆群的部分亚克隆测序,设计了一系列SSLP和CAPS标记对目标基因进行精细遗传定位.xa5基因定位在2个CAPS标记K5和T4之间且与T2共分离,标记K5和T4之间的遗传距离为0.3 cM,物理距离约为24 kb.对xa5基因所在的24 kb片段DNA序列进行基因预测,揭示出可能编码ABC转运蛋白和转录因子TFIIA小亚基的2个基因.对这一区段及其编码基因的功能研究将阐明xa5抗白叶枯病的分子机制.     

一个先天性小眼球家系致病基因的排除性定位

先天性小眼球是一种先天发育异常性眼科疾病. 通过基因扫描和连锁分析对一个6代常染色体显性遗传先天性小眼球中国家系的疾病相关基因进行研究. 根据已报道的与小眼球相关的5个基因座位(MITF, SOX2, PAX6, MCOP和NNO2), 在3, 11, 14和15号染色体上选取了14个微卫星标记, 以荧光标记引物的聚合酶链反应(PCR)扩增目的片段, 用ABI 377 DNA遗传分析仪对该家系成员进行基因扫描和基因分型, 并采用Linkage软件包对基因分型结果进行连锁分析. 结果显示, 该家系致病基因与这些已报道的座位均不连锁, 即该家系致病基因不是已报道的座位, 可能是一个尚未报道的对眼球发育至关重要的新基因座位.     

稻瘟病菌新无毒基因AvrPi7的遗传及物理作图

稻瘟病是目前最具毁灭性的作物病害之一. 本研究通过由田间菌株CHL346和CHL42杂交得到的189个子囊孢子菌株构建的分离群体, 在亲本菌株CHL346中鉴定到了与水稻稻瘟病抗性基因Pi7对应的无毒基因AvrPi7. 为了确定AvrPi7位点的染色体位置, 本研究开发了一套基于稻瘟病菌测序菌株70-15全基因组序列的121个微卫星(simple sequence repeat, SSR)标记. 利用这些SSR标记对AvrPi7位点进行了连锁分析. 结果表明, 位于第1染色体的8个SSR标记与该无毒基因连锁, 其中2个最近的侧翼标记MS1-9和MS1-15分别距离AvrPi7位点3.2和16.4 cM. 为了进一步完成该位点的精细作图, 在MS1-9和MS1-15的侧翼区域进一步开发了8个SSR标记和3个候选无毒基因(candidate avirulence gene, CAG)标记. 通过对这些标记的连锁分析, AvrPi7位点被界定于标记MS1-21和MS1-22之间1.6 cM的区域内, 并与标记CAG2共分离. 为了构建该无毒位点的物理图谱, 通过生物信息学分析(bioinformation analysis, BIA), 将与该基因连锁的分子标记分别着陆于参考菌株70-15的超重叠群(supcontig)上. AvrPi7位点最终被界定在标记MS1-21和MS1-22之间的75 kb区段内. 本研究的结果对于进一步了解真菌中普遍存在的重组不平衡和部分二倍体等现象, 以及对该基因进行克隆及其功能研究具有重要意义.     

与Gm-6和Pi-5(t)连锁的栽培稻BAC克隆在药用野生稻中的FISH定位

用栽培稻遗传图第4连锁群中与抗稻瘿蚊和抗稻瘟病基因, Gm-6和Pi-5(t)连锁的RFLP标记RG214和RZ565及其筛选出来的2个BAC克隆作探针, 对药用野生稻荧光原位杂交. 供试探针均被定位于第4染色体长臂, 百分距分别为74.18±2.62, 52.33±3.78, 72.33±2.62和54.50± 5.43, 信号检出率为8.3%, 9.8%, 52.70%和61.2%. BAC克隆和RFLP标记探针杂交位置几乎一致, 说明在栽培稻和野生稻中RFLP标记RG214和RZ565都在同一BAC克隆的大插入片段中, 药用野生稻与抗性基因Gm-6和Pi-5(t)的同源顺序就在第4染色体信号出现的相应位置. 在未封阻的情况下, 药用野生稻多个染色体上具有信号, 这表明药用野生稻和栽培稻的Cot1DNA重复顺序也在一定的程度上具有同源性. 药用野生稻第4染色体是根据Jena等(1994)和RFLP杂交的结果确定的, 并讨论了栽培稻BAC克隆对药用野生稻原位杂交物理作图的可行性等问题.     

高赖氨酸含量基因在转基因小麦的表达及其赖氨酸含量分析

构建了含高赖氨酸含量基因(wblrp)和赖氨酸合成关键酶(dapA)基因的植物表达载体pBPC102,用基因枪导入京花1号、京411、优899和烟农15等受体品种的幼穗和幼胚,获得了100多株转基因小麦植株(T0)及其后代株系(T1～T2).PCR和PCR-Southern杂交结果表明,外源基因已稳定整合到转化植株To和T1的基因组中.进一步用RNA分子杂交的方法对高赖氨酸基因的表达及水平调控进行了深入研究,结果表明外源基因已在T2不同株系中获得了表达.植株叶片游离赖氨酸(Lys)含量和种子结合态Lys含量的测定和分析结果表明,有9个转基因植株后代株系叶片的游离Lys含量提高了2～3倍,4个株系的Lys含量提高了10%以上,小麦的营养品质得到了显著的改善.     

普通小麦中来自黑麦的抗白粉病Pm20基因的抗谱分析和AFLP定位

用24个在我国具有代表性的小麦白粉菌已知毒性菌株,对两个不同来源的小麦-黑麦6BS_6RL易位系进行了抗病性鉴定,表明Pm20基因已发生抗谱分化.以这两个材料为亲本配制TAM104R×TAM104S杂交组合获得F2分离群体,对亲本和F2分离群体进行AFLP分析.亲本DNA经PstⅠ/TaqⅠ双酶切消化,并接上各自的接头,然后以其接头为基础加1个或3个碱基,分别经过两次PCR扩增.结果16对PstⅠ/TaqⅠ引物组合(4个PstⅠ引物,4个TaqⅠ引物)PCR扩增出2290条带,共获得3个与该基因连锁的分子标记,分别位于Pm20基因的一端2.6和11.6cM,另一端3.6cM处,实现了对Pm20基因的连锁分析.     

蛋白质核酸分子在固体介质中能形成专一结合的复合物

为阐明生命活动的一些基本过程,如DNA复制、重组及基因调控等,归根结蒂,需要对蛋白质核酸的相互作用有详尽的了解。近年来用凝胶电泳定量研究蛋白质核酸的相互作用已有重大突破,所用方法非常灵敏,蛋白质和核酸的浓度只需10~(-12)—10~(-14)mol/L。其基本原理如下:一般先将有关的DNA片段用放射性同位素标记,然后用它与细胞抽提物混合,细胞抽提物中能与DNA专一结合的蛋白质就与DNA形成蛋白质核酸复合物,它在凝胶电泳中     

水稻籼粳杂种不育基因座Sc的遗传图

杂种不育是水稻籼粳亚种间杂种优势利用的主要障碍. 为了克隆1个籼粳杂种不育基因Sc, 利用分子标记和近等基因系杂交产生的F2群体对Sc座位进行了精细定位. 初步的连锁分析结果表明, Sc座位与第3染色体的4个分子标记以RM218-RG369-Sc-RG227-RG391的关系连锁, 其中RG227与Sc座位之间的遗传距离为0.07 cM. 用RG227为起始探针筛选籼稻的TAC基因组文库, 并通过染色体步移构建了一个覆盖Sc座位的跨度约320 kb的克隆重叠群. 对可能覆盖Sc的2个TAC克隆M45E14和M90J01进行了部分测序. 用TAC克隆序列和RG227序列搜索水稻基因组序列数据库, 锚定了粳稻BAC克隆OSJNBb0078P24(148 kb)序列. 通过比较TAC和BAC克隆的序列, 在Sc座位区域发展了6个新的基于PCR的标记. 用这些标记进一步把Sc座位定位在一个约46 kb的区域内. 从定位结果推测该BAC克隆和TAC克隆M45E14包含Sc基因. 基因预测分析显示, 在此46 kb区域内有6个预测的ORF.     

水稻籼粳杂种不育基因座Sc的遗传图和物理图精细定位

杂种不育是水稻籼粳亚种间杂种优势利用的主要障碍.为了克隆1个籼粳杂种不育基因Sc,利用分子标记和近等基因系杂交产生的F2群体对Sc座位进行了精细定位.初步的连锁分析结果表明,Sc座位与第3染色体的4个分子标记以RM218-RG369-Sc-RG227-RG391的关系连锁,其中RG227与Sc座位之间的遗传距离为0.07 cM.用RG227为起始探针筛选籼稻的TAC基因组文库,并通过染色体步移构建了一个覆盖Sc座位的跨度约320kb的克隆重叠群.对可能覆盖Sc的2个TAC克隆M45E14和M90J01进行了部分测序.用TAC克隆序列和RG227序列搜索水稻基因组序列数据库,锚定了粳稻BAC克隆OSJNBb0078P24(148kb)序列.通过比较TAC和BAC克隆的序列,在Sc座位区域发展了6个新的基于PCR的标记.用这些标记进一步把Sc座位定位在一个约46kb的区域内.从定位结果推测该BAC克隆和TAC克隆M45E14包含Sc基因.基因预测分析显示,在此46 kb区域内有6个预测的ORF.     

中国对虾遗传连锁图谱的构建

中国对虾是中国重要的水产资源之一, 其自然群体主要分布于中国黄渤海沿海海域和朝鲜半岛海域. 中国对虾遗传连锁图谱的构建, 可以加速分子标记辅助育种和控制重要经济性状基因鉴定的研究, 为中国对虾遗传改良和优良品种的培育提供基础信息. 利用中国对虾F₂群体家系和AFLP分子标记技术进行了中国对虾遗传连锁图谱的构建. 利用55对AFLP引物组合对F₂家系的110个个体进行了研究, 检测到532个符合作图策略的AFLP标记. 对于符合3∶1比例的分离位点利用F₂自交模型构建性别平均连锁图谱, 对于符合1∶1比例的分离位点利用拟测交理论分别构建中国对虾的雌性和雄性遗传连锁图谱. 雌性遗传图谱分别由103标记组成28个连锁群, 没有未连锁标记, 图谱长度分别为1090 cM. 雄性遗传图谱由144个标记构成35个连锁群, 有10个未连锁标记, 图谱长度分别为1617 cM. 中国对虾雄性遗传连锁图谱比雌性遗传连锁图谱长32.6%, 这可能说明中国对虾不同性别存在不同的重组率. 性别平均遗传图谱有44个连锁群, 由216个标记组成, 有2个未连锁标记, 图谱实际长度为1772.1 cM. 中国对虾遗传连锁图谱基因组估计长度为2420 cM, 符合与人类基因组相比的对虾类基因组长度. 通过皮尔逊相关系数检测认为AFLP标记在中国对虾图谱上分布均匀. 本研究利用AFLP标记构建的中国对虾遗传连锁图谱为中国对虾基因组研究和遗传改良提供一定的基础, 同时开发的微卫星标记也为遗传连锁图谱的整合提供条件.