Egfl3在肝癌组织及细胞系中的表达水平及意义

目的:研究表皮细胞生长因子3(Egfl3)在肝癌组织及细胞系中的表达及其与肝癌病理临床特性的相关性.方法:采用荧光实时定量PCR(RT-qPCR)检测Egfl3基因在20对肝癌及相应癌旁肝组织,5株迁移、侵袭潜能不同的肝癌细胞系(SMMC-7721、BEL-7402、Huh-7、HepG2、Hep3B)和正常肝细胞系HL-7702中的表达水平;采用免疫组化检测Egfl3蛋白在40对肝癌及相应癌旁肝组织石蜡切片中的表达水平并分析其表达与肝癌临床病理特性的相关性.结果:RT-qPCR结果显示,Egfl3基因在20对肝癌组织中的表达水平(0.77±0.15)显著高于相应的癌旁肝组织(0.25±0.10)(t=2.904,P=0.006).Egfl3在5株肝癌细胞系中的表达水平也均明显高于正常肝细胞系HL-7702(P<0.05),且在侵袭迁移潜能中等的肝癌细胞系SMMC-7721中的表达高于侵袭迁移潜能较低的肝癌细胞系Bel-7402和Huh-7,后者又高于侵袭迁移潜能最低的肝癌细胞系HepG2和Hep3B.免疫组化结果显示Egfl3蛋白大多数表达于肝癌细胞或正常肝细胞的胞质内,并在62.5％(25/40)的肝癌组织中的表达显著高于相应的癌旁肝组织,且其表达与肝癌的TNM分期密切相关(P=0.04).结论:Egfl3在肝癌组织及细胞系中的表达显著上调,且其上调与肝癌的TNM分期及肝癌细胞的侵袭迁移潜能密切相关.     

P53和MDM2蛋白表达对肝细胞肝癌预后判断的意义

目的 :研究肝细胞肝癌中突变型P5 3和MDM2蛋白的表达对临床预后判断的意义。方法 :应用免疫组织化学方法 ,检测 72例原发性肝细胞肝癌手术切除标本突变型P5 3、MDM2蛋白的表达 ;与临床病理学指标和术后生存期进行分析比较。结果 :突变型P5 3蛋白阳性 2 8例(38 89% ) ,MDM2蛋白阳性 2 3例 (31 94 % ) ,二者阳性表达有相关性 (r =0 2 4 8,P <0 0 5 )。突变型P5 3、MDM2蛋白阳性表达病例生存率明显低于突变型P5 3、MDM2蛋白阴性表达病例 (P <0 0 1)。突变型P5 3和MDM2蛋白表达均阳性病例 13例 (18 0 6 % ) ,中位生存期的生存率最低。单因素及多因素分析显示 ,突变型P5 3蛋白表达、MDM2蛋白表达、肿瘤大小与中位生存期的生存率有关 ,MDM2是统计学上最有意义的独立预后指标 (P <0 0 0 0 1)。结论 :应用免疫组织化学方法检测突变型P5 3和MDM2蛋白的表达可作为原发性肝细胞肝癌预后判断的指标。     

Bmi-1蛋白在食管鳞状细胞癌中表达及临床意义

目的:观察Bmi-1蛋白在食管鳞状细胞癌组织中的表达,探讨Bmi-1与食管鳞状细胞癌的相关性.方法:应用免疫组织化学法检测南京医科大学附属淮安第一医院2005年1月至2006年2月间168例食管鳞状细胞癌组织和30例正常食管黏膜组织Bmi-1蛋白的表达.结果:食管鳞状细胞癌组织和正常食管黏膜组织中Bmi-1蛋白的阳性表达率分别为66.1%(111/168)、23.3%(7/30),Bmi-1蛋白阳性表达率在食管鳞状细胞癌组织和正常食管黏膜组织中差异具有统计学意义(P<0.001),Bmi-1蛋白表达与食管鳞状细胞癌组织学分级、TNM分期和淋巴结转移具有相关性(P=0.016,P=0.004,P<0.001),Bmi-1阴性组的5年生存率显著优于Bmi-1阳性组(P<0.001).结论:Bmi-1表达异常在食管鳞状细胞癌发生发展中具有重要作用,检测Bmi-1的表达对判断食管鳞状细胞癌的预后具有重要意义.     

CRISPR/Cas9敲低环氧合酶2表达对黄曲霉毒素B1诱导肝细胞核DNA损伤与脂质蓄积的影响

为探讨黄曲霉毒素B1(AFB1)诱导的肝细胞核DNA损伤与脂质蓄积的关系,以慢病毒质粒为载体,采用CRISPR/Cas9技术构建含靶向环氧合酶2(COX-2)编码基因(PTGS2)小向导RNA(sgRNA)的重组质粒,经测序验证成功后,制备假病毒感染HepG2细胞,构建稳定敲低COX-2表达的细胞.通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(WB)检测mRNA和蛋白水平,结果显示与HepG2-Cas9-NC对照细胞相比,HepG2-Cas9-PTGS2敲低细胞中PTGS2 mRNA与COX-2蛋白表达水平分别减少至(49.1±1.8)%和(48.1±0.7)%.给予细胞AFB1处理,通过WB和免疫荧光(IF)法检测DNA损伤标志物γH2AX的表达水平,结果显示处理组敲低细胞中,γH2AX蛋白水平和荧光焦点形成数目显著低于对照细胞(p0.05);进一步检测脂质合成相关指标,发现敲低细胞中PPARγ蛋白、总胆固醇(TC)、总甘油三脂(TG)水平以及油红O染色阳性脂滴的分布密度,均显著低于对照细胞中(p0.05).在敲低细胞中回补COX-2后给予AFB1处理,γH2AX蛋白水平和脂质分布密度均显著升高(p0.05).综上,成功构建了HepG2-Cas9-PTGS2敲低细胞,并发现敲低COX-2表达对AFB1诱导的肝细胞核DNA损伤和脂质蓄积有显著抑制作用,为进一步研究靶向干预COX-2在外源化学物诱导肝细胞毒性中的作用机制提供了细胞模型和依据.     

重组腺病毒Canstatin对人肝癌HepG2细胞增殖影响的研究

为研究重组腺病毒Canstatin感染人肝癌HepG2细胞及细胞转染后Canstatin在HepG2细胞中的表达,探讨Canstatin基因对人肝癌HepG2细胞生长增殖的影响。采用不同感染复数(MOI=10、40、80)的腺病毒Ad-Canstatin-GFP感染HepG2细胞,倒置荧光显微镜下观察细胞形态,流式检测感染效率,Real-Time PCR和Western blot法检测HepG2细胞中Canstatin mRNA和蛋白表达。CCK-8法检测细胞增殖能力的变化,Western blot法检测细胞中PCNA蛋白的表达。结果显示MOI为40时,72 h感染率可达到98.9%,HepG2细胞中Canstatin mRNA和蛋白表达均高于对照组和空载体组(P0.05)。HepG2细胞感染Ad-Canstatin腺病毒后生长增殖受到抑制(P0.05),且PCNA的表达低于对照组(P0.05)。由此可知,Canstatin抑制人肝癌HepG2细胞的生长增殖有作用可能与影响PCNA的表达有关。     

三叶青根多糖对HepG2细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响

目的:探讨三叶青根多糖(RTP)对肝癌细胞HepG2增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响及其机制.方法:不同质量浓度(0.65、1.25、2.5、5、7.5、10 mg/mL)的RTP作用于肝细胞L-02不同时间(24、48和72 h),MTT法检测细胞增殖,筛选出对肝细胞L-02无毒性的RTP质量浓度.对肝细胞L-02无毒性质量浓度的RTP作用于HepG2细胞24、48和72 h后,MTT法检测细胞增殖,筛选出RTP对HepG2细胞的最佳作用质量浓度和时间.最佳质量浓度的RTP干预HepG2细胞一定时间(最佳作用时间)后,流式细胞仪检测细胞凋亡,Transwell检测细胞迁移和侵袭,qRT-PCR法和Western Blot法分别检测细胞中P21、Cyclin D1、Bcl-2、Bax、E-cadherin和MMP-2的mRNA和蛋白表达水平,qRT-PCR检测细胞中miR-151表达水平.转染miR-151抑制剂抑制HepG2细胞中miR-151表达,检测抑制miR-151表达后HepG2细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭及细胞中P21、Cyclin D1、Bcl-2、Bax、E-cadherin和MMP-2的mRNA和蛋白表达情况.结果:低质量浓度(0.65、1.25、2.5 mg/mL)RTP对肝细胞L-02无毒性.RTP作用HepG2细胞的最佳作用质量浓度和时间分别为1.25 mg/mL、48 h,1.25 mg/mL的RTP及抑制miR-151表达均可降低HepG2细胞活性、迁移和侵袭细胞数及细胞中Cyclin D1、Bcl-2和MMP-2的mRNA和蛋白表达水平(P0.05),提高HepG2细胞凋亡率及细胞中P21、Bax和E-cadherin的mRNA和蛋白表达水平(P0.05).并且RTP可抑制HepG2细胞中miR-151表达.过表达miR-151且同时用1.25 mg/mL的RTP作用HepG2细胞时,细胞活性、迁移和侵袭数及细胞中Cyclin D1、Bcl-2和MMP-2的mRNA和蛋白表达水平升高(P0.05),细胞凋亡率及细胞中P21、Bax和E-cadherin的mRNA和蛋白表达水平降低(P0.05).结论:RTP可抑制肝癌HepG2细胞增殖、迁移和侵袭,并诱导其凋亡,其作用机制可能与下调miR-151表达有关.     

新型雌激素受体ERα36在张氏肝细胞和人肝癌细胞中的表达比较分析

研究新型雌激素受体ERα36在人肝细胞和肝癌细胞系中的差异表达具有重要的意义.以张氏肝(Chang Liv-er)、Caveolin-1基因沉默细胞株CAV7、人肝癌细胞系SMMC-7721和HepG2为实验材料,通过免疫印迹杂交法观察了不同细胞内ERα36蛋白的表达情况,并与典型雌激素受体亚型ERα66蛋白的表达进行了比较.结果发现:(1)几种细胞中均有ERα36蛋白的表达;(2)与张氏肝细胞相比,Caveolin-1基因沉默时ERα36表达明显增加(P0.01);(3)ERα36在SMMC-7721中表达水平较低,而在HepG2细胞中表达水平较高,与ERα66和Caveolin-1的表达水平相关.提示新型雌激素受体ERα36可能参与Caveolin-1介导的雌激素信号转导,而在肝细胞的恶性增殖过程中发挥一定的作用.     

基于PD-L1蛋白调控的五味子酚对肝细胞癌细胞增殖的影响

目的 探究五味子酚(Schisanhenol)对肝细胞癌细胞增殖及作用机制的影响。方法 将HepG2细胞分为空白对照组和五味子酚3、10、30μmol/L 3个浓度组。应用Western Blot检测HepG2细胞PD-L1蛋白表达;通过免疫荧光试验进一步检测五味子酚对PD-L1蛋白表达的影响;通过集落试验观察HepG2细胞的增殖情况。结果 HepG2细胞PD-L1蛋白表达结果显示,3、10、30μmol/L五味子酚均可显著抑制PD-L1蛋白表达(P<0.05或P<0.01),且抑制效果呈剂量依赖性;免疫荧光试验和集落试验结果显示,30μmol/L五味子酚对HepG2细胞增殖有显著的抑制作用(P<0.01)。结论 五味子酚通过调节PD-L1蛋白表达抑制肝细胞癌细胞HepG2增殖。     

稳定表达Cytoglobin的肝细胞株LO-2的建立及生长增殖的变化

目的:建立过表达细胞珠蛋白Cytoglobin(CYGB)的人肝细胞LO-2稳定株,初步探究CYGB对LO-2细胞生长增殖的影响.方法:采用PCR法扩增CYGB编码基因,并通过GATEWAY克隆技术构建慢病毒重组表达载体Plenti-N-GFP-CYGB;酶切、测序鉴定后,与包装质粒三质粒共转人肾上皮细胞(HEK293T),收集、浓缩含病毒上清,获得病毒颗粒;感染LO-2细胞并采用流式细胞分选技术筛选稳定细胞株,Western blot检测表达情况;使用CCK-8试剂盒检测过表达CYGB对LO-2细胞增殖的影响,通过流式细胞技术检测过表达CYGB对LO-2细胞凋亡的影响.结果:慢病毒重组表达载体Plenti-N-GFP-CYGB双酶切鉴定以及基因序列比对鉴定均正确.三质粒共转HEK293T细胞后,荧光显微镜下观察大部分细胞出现绿色荧光;收集病毒颗粒并感染LO-2细胞后,经流式细胞分选技术筛选获得稳定表达CYGB的细胞,Western blot鉴定显示,LO-2稳定株组的CYGB表达条带明显,阴性对照组未出现条带.CCK-8法绘制的细胞生长曲线显示,稳定表达细胞组的细胞生长速率低于阴性对照组,有统计学差异(P0.01).流式细胞技术检测各组LO-2细胞凋亡情况结果显示,稳定表达细胞组的细胞凋亡百分比高于阴性对照组(P0.05).结论:成功构建慢病毒重组表达载体Plenti-N-GFP-CYGB;建立稳定表达CYGB的人肝细胞株LO-2-GFP-CYGB以及阴性对照组细胞株LO-2-GFP;稳定表达CYGB的肝细胞生长速率较阴性对照组肝细胞降低,稳定表达CYGB的肝细胞凋亡百分比高于阴性对照组肝细胞;为CYGB与其蛋白的相互关系研究提供了细胞模型.     

p53蛋白与肝细胞癌临床病理特征及预后的关系

目的 探讨p53蛋白表达与肝细胞癌的临床病理特征及预后的关系,为术后综合治疗及判断预后提供依据。方法 采用免疫组织化学方法检测88例肝细胞癌组织中p53蛋白的表达,比较阳性患者和阴性患者的临床病理因素和术后累积复发率、术后累积生存率的差异。结果 p53蛋白表达阳性组1、2、3累积生存率分别为75．0％、54.4%、24．2％,阴性组相应的分别为84．3％、77．8％、56．1％。与阴性组相比,p53蛋白阳性组有较高的术前AFP浓度（P=0．005）、有较大的肿瘤最大直径（P=0．042）、肿瘤包膜不完整或无包膜者多见（P=0．023）。结论 p53蛋白是评价肝细胞癌恶性程度及预后的一个有价值的生物学指标。     

环氧合酶-2在大肠癌组织中的表达及临床意义的研究

目的探讨COX-2蛋白在大肠癌中的表达与肿瘤发生发展和转移的关系.方法应用免疫组化SP法检测COX-2蛋白在66例大肠癌及22例正常大肠组织的表达情况.结果COX-2蛋白在66例大肠癌组织中高表达(56/66),阳性表达率84.8%,与正常大肠组织相比差异有显著性(P<0.01);COX-2蛋白的表达与肿瘤组织的浸润深度显著相关(P<0.05);与Dukes分期呈正相关(P<0.05);淋巴结有转移组与无转移组差异有显著性(P<0.05).结论COX-2在大肠癌的发生、发展及浸润、转移过程中发挥着重要作用,可望成为预测大肠癌恶性潜能的临床指标之一.     

用双探针原位杂交法检测常见肝病组织中输液传染性病毒DNA

目的：建立肝组织输液传染性病毒DNA(TTVDNA)的原位杂交检测技术，探讨TTVDNA在肝组织中的分布。方法：采用PCR扩增法，分别合成地高辛标记的Gla、G2b两种亚型的双链TTVDNA探针。同时应用两型探针对22例血清学检查无甲-庚型肝炎病毒感染的肝病患者肝组织TTVDNA进行原位杂交检测，并将检测结果与巢式PCR法检测配对血清TTVDNA的结果进行比较。结果：原位杂交阳性信号主要定位于肝细胞核，少数位于胞浆。22例肝病患者肝组织标本中TTVDNA原位杂交阳性率68.2％（15/22），其中慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌患者中原位杂交阳性率83.3％（15/18），4例肝破裂、肝良性肿瘤患者TTVDNA原位杂交检测皆为阴性。配对血清TTVDNA阳性率63.6％（14/22）。血清与肝组织TTVDNA检测符合率86.4％（19/22）。结论：双探针原位杂交检测具有较高的特异性和灵敏性，有助于肝病病因的分析。TTVDNA在慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌的肝组织中检出率较高，提示TTV可能与这些肝病有关。     

Controlled expression of enhanced green fluorescent protein and hepatitis B virus precore protein in mammalian cells

A novel tetracycline regulation expression system was used to regulate the expression of enhanced green fluorescent protein (EGFP) and hepatitis B virus precore protein in the mammalian cell lines with lipofectAMINE. Flow cytometry assays showed that application of the system resulted in about 18-fold induction of EGFP expression in CHO cell lines and 5-fold induction in SSMC-7721 cells and about 2-fold in the HEK293 cells. Furthermore, the effective use of this system for the controlled expression of HBV precore protein gene in hepatocellular carcinoma cells was tested.     

单胺氧化酶活性分析在HBV感染者中的应用

目的分析乙肝病毒(HBV)感染者血清单胺氧化酶活性,研究其临床应用价值.方法应用终点比色法检测血清单胺氧化酶(MAO)活性;ELISA法检测乙肝病毒标志物;PCR法检测HBv DNA;常规方法检测ALT.结果 ALT异常组,大三阳HBsAg(+),HBeAg(+),Anti-HBc(+)和小三阳HBsAg(+),Anti-HBe(+),Anti-HBc(+)合并HBV DNA阳性的HBV感染者MAO显著升高,而小三阳并HBV DNA阴性者MAO升高不明显;ALT正常组仅40例大三阳患者MAO升高明显,其他各组MAO大多在正常范围内.结论 HBV感染后,只要有病毒复制,就会破坏肝细胞,引起MAO升高.MAO活性分析对肝脏病情的判断有重要价值.     

广西肝癌中HBV感染与N-ras基因突变的研究

应用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ和免疫组化法检测２９例广西南部肝癌组织中的Ｎ－ｒａｓ基因突变和ＨＢＶ感染状况，结果，肝癌中Ｎ－ｒａｓ基因在第２￣３７密码子之间的突变率为７９．３％，其中２２例有２￣５个突变位点，该基因突变也见于癌旁组织，肝组织中ＨＢｓＡｇ和ＨＢｓＡｇ和ＨＢｘＡｇ检出率分别为８６．２％和７９．３％，两者具有相关性，并与Ｎ－ｒａｓ基因突变率呈相平行的趋势。因广西南部的肝癌与ＡＦＢ１污染有关，本研究     

中国大陆乙型肝炎病毒基因分型的研究进展

目的:综述乙型肝炎病毒的分子基因型在中国境内的地理分布的特点、临床特征和治疗疗效的关系。方法:收集并综述近五年中国大陆的研究成果。结果:虽然HBV有8个基因型,但中国大陆只有4个基因型别流行,其分布表现出明显的地域性。结论:中国大陆HBV基因型与HBV自然史、致病性、预防、治疗等关系的研究为今后控制乙型肝炎提出了方向。     

Bcl-2家族蛋白和乙肝病毒x蛋白在肝癌组织中的表达和意义

应用免疫组织化学方法检测了34例肝癌组织及其相对应的癌旁组织,探讨了Bcl-2家族中七种基因(包括促凋亡基因Bak、Bad、Bid、Bax和Bcl-xs及抑凋亡基因Bcl-2、Bcl-w)和乙肝病毒三种抗原(包括HBsAg、HBcAg和HBxAg)在肝癌组织中的表达及意义,结果显示:在肝癌组织中HBsAg、HBcAg和HBxA的阳性率分别为58.8％、26.5％和76.5％、Bcl-2七种蛋白的阳性率分别为58.8％(Bak)、55.9％(Bad)、44.1％(Bid)、41.2％(Bax)、29.4％(Bcl-xs)、35.3％(Bcl-w)和41.2％(Bcl-2)。这七种Bcl-2蛋白的表达均位于肝癌细胞的胞浆,多呈弥漫性分布,少数阳性颗粒呈散在性分布,研究发现,Bcl-2家族中抑凋亡基因Bcl-w和Bcl-2在癌组织中表达的阳性率明显高于癌旁组织(P相似文献   

乙型肝炎病毒x基因蛋白转导载体的构建

乙型肝炎病毒X蛋白在细胞转化和肝癌的发生发展中具有重要作用.为了深入研究X蛋白的致癌机理构建了pTAT-GFP-X载体.该研究以克隆在真核表达载体pCMV-X质粒中的x基因为模板,设计了x基因的PCR引物,采用PCR方法扩增x基因,回收PCR产物,以XhoI和EcoRI酶切位点将PCR产物连接到蛋白转导系统pTAT-GFP载体中,再用XhoI和EcoRI酶对筛选的重组子进行酶切鉴定,获得了510bp的目的片段,表明已成功地将目的片段克隆在pTAT-GFP载体中.经DNA序列分析检测,显示克隆的x基因无突变.经SDS-PAGE和Westernblot检测证实,将重组质料pTAT-GFP-X转化致大肠杆菌BL21中,可表达pTAT-GFP-X融合蛋白.该pTAT-GFP-X载体蛋白转导系统的构建,为进行X蛋白的蛋白转导实验奠定了基础.pTAT-GFP-X融合蛋白具有穿透细胞膜进入细胞的能力,进而在细胞内发挥作用,与转基因不同,无需细胞内基因表达的过程,使得X蛋白的定量实验成为可能,X蛋白的蛋白转导实验更有助于探讨x基因的致癌机理.     

血管内皮生长因子表达及微血管密度与头颈肿瘤发展和转移的关系

研究血管内皮细胞生因子(VBGV)的表达及微血管密度(MVD)与头颈肿瘤发展及转移的关系.应用免疫组织化学S-P法,检测32例头颈恶性肿瘤、20例头颈良性肿瘤、16例头颈部无瘤组织石蜡标本组织中的血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达、微血管密度(MVD).头颈恶性肿瘤组织VEGF的表达及MVD明显高于头颈良性肿瘤及头颈无瘤组织(P<0.05),转移组比较非转移组高(P<0.05).此外,在头颈肿瘤的发展及转移中VEGF的表达及MVD具有显著的正相关关系(r=0.398,<0.05).VEGF与头颈肿瘤血管生成有密切关系;VEGF的表达和MVD的增高对头颈肿瘤发展及转移有促进作用,其检测有可能作为头颈肿瘤预后的指标.