用CODEHOP设计简并引物克隆杜氏盐藻hog1基因片段

根据NCBI上已经报道的hog1序列,利用简并引物在线设计工具CODEHOP设计出两对简并引物,通过巢式PCR扩增,得到一段大小为635 bp的基因片段,将其克隆到T载体上并测序,将测得的序列在NCBI的Blast搜索发现,其与已报道的其他一些物种的hog1基因有同源性.用CODEHOP程序化设计简并引物可信性强,阳性率高.该基因的成功克隆为研究杜氏盐藻的HOG信号途径奠定了基础.     

简并引物法克隆保加利亚乳杆菌β-N-乙酰氨基己糖苷酶基因

β-N-乙酰氨基己糖苷酶(β-Hexcase)在细菌、植物和动物中广泛存在,具有典型的外切酶活性并可以催化切除β-N-乙酰氨基己糖的非还原性氨基己糖残基,在细菌细胞分裂中具有重要作用.选取与保加利亚乳杆菌LJJ亲缘关系近的菌种的β-N-乙酰氨基己糖苷酶蛋白序列,利用ICO-DEHOP和CODEHOP在线简并引物设计软件设计β-Hexcase简并引物,选取Hex1-f和Hex1-r引物对,以LJJ基因组DNA为模板经PCR扩增得到614 bp产物.PCR产物连接pGEM-T质粒载体后克隆至大肠杆菌DH5α中,筛选阳性克隆提取质粒进行测序.测序结果显示产物长度为614 bp,该DNA序列经blastx比对发现与其他已知β-Hexcase基因具有相似性,表明所克隆的序列即为LJJβ-Hexcase的基因片段.β-N-乙酰氨基己糖苷酶基因的获得为进一步研究β-N-乙酰氨基己糖苷酶与保加利亚乳杆菌自溶的关系奠定了基础.     

酒色着色菌Chromatium vinosum膜结合态氢酶基因hupSL的克隆及分析

光合细菌酒色着色菌(Chromatiumvinosum)含有Hup膜结合态氢酶.根据同科的桃红荚硫菌(Thiocapsaroseopersicina)Hup氢酶同源序列,在结构基因小亚基hups和hupC的保守框上设计1对简并引物:Ps:5’CCGACCAC(C/G)TACAACGCCTG3’和Pc:5’CG(G/C)GACATGATGTC(T/C)TCGCG3’.通过PCR扩增获得2.6kb的扩增片段,克隆后进行序列分析.结果表明,该片段包含部分的小亚基hupS序列、大亚基hupL的全序列及hupC部分序列.从已知的hupS序列选取适当位点合成引物AS2:5’CTACGACCATGTCACCGACA3’,并利用接头寡核苷酸序列P6:5’CCTTGTGAAATTGTTATCCGCT3’,通过PCR扩增获得1.2kb的扩增片段,克隆后进行序列分析.结果表明,该片段包含完整的膜结合态氢酶的小亚基基因hupS.     

玉米候选抗病相关基因片段的克隆

根据已经克隆的植物抗病基因和候选抗病基因的保守序列P-loop、Kinase-2及GLPLAL设计一系列简并引物，利用同源序列扩增法，对玉米的基因组DNA进行PCR扩增，并对5个扩增产物的克隆进行测序．测序结果在Gen—Bank内进行BLAST检索，发现A9克隆序列与玉米BAC库中的206C17克隆的部分序列有很高的相似性，并且距离GenBank内注册的玉米抗锈病基因rpl位点中的rpl-3基因、rpl-4基因分别约有66Kb、20Kb，且A9克隆序列在玉米基因组中是单拷贝的．这为玉米抗锈病性状的分子标记辅助选择和抗锈病基因的克隆奠定了良好的基础。     

利用CODEHOP设计简并引物克隆红色红曲霉丝氨酸羧肽酶基因片段和序列分析

利用CODEHOP(Consensus-Degenerate Hybrid Oligonucleotide Primers)软件设计了红色红曲霉丝氨酸羧肽酶基因片段的简并引物,选取1对简并引物进行逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),得到348 bp的聚合酶链式反应产物,经pMD18-T载体克隆转化至大肠杆菌DH5α中,测序后进行BLASTX比对,发现此DNA产物与其他丝氨酸羧肽酶基因序列有相似性,推断所克隆的产物即为红色红曲霉的丝氨酸羧肽酶基因片段.     

玉米候选抗病相关基因片段的克隆

根据已经克隆的植物抗病基因和候选抗病基因的保守序列P-loop、Kinase-2及GLPLAL设计一系列简并引物，利用同源序列扩增法，对玉米的基因组DNA进行PCR扩增，并对5个扩增产物的克隆进行测序，测序结果在GenBank内进行BLAST检索，发现A9克隆序列与玉米BAC库中的206C17克隆的部分序列有很高的相似性，并且距离GenBank内注册的玉米抗锈病基因rpl位点中的rpl-3基因、rpl-4基因分别约有66Kb、20Kb，且A9克隆序列在玉米基因组中是单拷贝的，这为玉米抗锈病性状的分子标记辅助选择和抗锈病基因的克隆奠定了良好的基础．     

杜氏盐藻光系统Ⅱ反应中心蛋白D2 基因的克隆及序列分析

根据莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、Oryza sativa、Chlorella vulgaris以及Mesostigma viride 等真核生物的psbD基因的氨基酸高度保守序列,设计一对简并引物,利用TRIzol试剂提取杜氏盐藻(Dunaliella salina)细胞的总RNA,通过RT-PCR,得到杜氏盐藻cDNA片段的长度大约为1 000bp.该序列的PCR产物经T-A克隆并测序分析以及测序结果推导成氨基酸序列,Blast同源性分析表明所克隆的基因为杜氏盐藻psbD基因,编码杜氏盐藻光系统Ⅱ反应中心D2蛋白,该序列已递交GenBank(GenBank登录号为:DQ074450).编码的氨基酸序列,同源性依次为:Chlamydomonas reinhardtii 92%,Nephroselmis olivacea 88%,Pinus thunbergii 88%,Amborella trichopoda 88%,Chlorella vulgaris 88%.通过密码子偏爱性分析表明,psbD基因存在明显的密码子偏爱性,其(A T)含量明显高于(G C)含量.     

中国卤虫早期胚胎发育相关基因的研究——Orthodenticle基因克隆中简并引物的设计和优化

通过使用blastx、Blockmaker、CODEHOP和Primer Premier 5.0等在线网络工具和生物软件,针对中国卤虫Orthodenticle基因高度保守区域设计了简并引物.用所设计的简并引物克隆了中国卤虫Orthodenticle基因片段.在GenBank中以blastx方法进行比对,发现此段基因片段与美国卤虫Orthodenticle基因有高度的相似性.通过实验进一步证明,此种设计简并引物的方法可信性强,特异性高,能够快速得到满意的实验结果.     

盐生杜氏藻cbr基因的克隆

首先对其他物种cbr／elip基因的同源序列进行相似性分析,设计一对简并引物,利用TR—PCR技术获得-250bp的片段,经克隆测序分析发现其同D．bardwail的cbr基因有67．0％的同源性,然后再以此片段为模板设计引物,通过RACE技术构建盐生杜氏藻cbr基因的全长序列．     

一个紫红曲霉HR-PKS基因MpER1的克隆及序列分析

利用已知HR-PKS中ER结构域的保守氨基酸序列,通过设计简并引物,并使用本实验设计的巢式PCR方法从紫红曲霉(Monascus purpureus)中成功克隆得到一条长约300 bp的ER基因片段MpER1,再用Genome Walking的方法获得该HR-PKS中ER的基因全长序列.序列分析显示:该ER基因长为936 bp,编码312个氨基酸.将该ER基因序列与已知的ER基因序列比对,发现不同产物的ER基因同源性较差.该ER基因对应的氨基酸序列与A.clavatus 有最高的同源性,为88%.与其他物种如Nectria haematococca、Magnaporthe grisea等有50%左右的同源性.