大肠杆菌利用甘油生产1,2-丙二醇合成途径的构建及其代谢网络调节的研究

采用便宜易得的甘油为碳源,在大肠杆菌中构建了一条由磷酸二羟基丙酮生产1,2-丙二醇的异源代谢途径,通过敲除竞争支路醋酸的代谢途径,增强上游甘油到磷酸二羟丙酮的代谢通路,增加碳代谢流量及还原力,达到了平衡代谢网络中还原力和能量的目的。所构建的8株工程菌中,敲除菌株ΔtpiA得到了最好的发酵结果,1,2-丙二醇的产量达到1.3g/L,产率为0.21g/g。     

玻利维亚进口盐中可培养嗜盐古菌组成分析

嗜盐古菌是一类通常生活于高盐环境的极端微生物,独特的细胞结构和生理代谢系统赋予其重要的研究价值.本研究通过获取玻利维亚进口商品盐中嗜盐古菌资源,筛选一批具有较高胞外酶活、产嗜盐菌素的嗜盐古菌,并研究该生境中嗜盐古菌的群落组成.本研究采用不同pH值的嗜盐古菌培养基,以纯培养划线分离的方式,结合16 S rRNA基因的测序和序列相似性分析,获得所分离菌株的分类地位并进行物种多样性分析.此外,采用胞外酶活的检测方法,对部分菌株的胞外酶酶活和产嗜盐菌素能力进行筛查.最终从该样品盐中共分离到505株嗜盐古菌,分别来自于Natronococcus、Natrinema、Natrialba、Halovivax、Haloterrigena、Halorubrum、Halopenitus、Halobellus、Halococcus、Halobacterium、Halalkalicoccus、Haloarcula和Halosimplex等13个属,其中有180株属于Halobacterium属,占比约35.6％,是本研究纯培养分离所揭示的优势类群.物种多样性分析结果显示该样品中可培养嗜盐古菌数量较高、物种数目多,但优势种群明显且均匀度不高,总体而言多样性不高.不同pH培养基纯培养分离结果显示:pH8.0和pH9.0的培养条件下分离得到的菌株物种多样性较高:前者Shannon指数为2.8,simpson指数为0.9;后者Shannon指数为2.4,simpson指数为0.9.胞外酶活检测发现6株产胞外淀粉酶,5株产胞外明胶酶,2株产胞外蛋白酶菌株,胞外氧化酶和触酶活性在嗜盐古菌中较为普遍.拮抗作用检测获得1株产嗜盐菌素的菌株.本研究通过纯培养方法获得了丰富的嗜盐古菌菌株资源,并初步揭示了玻利维亚进口商品盐样品中可培养嗜盐古菌的群落组成和多样性分布.     

食油假单胞菌ZJ03利用甘油合成生物材料PHA研究

生物柴油是解决日益能源紧缺问题的可行途径之一,备受学术界和产业界关注,然而,在制备生物柴油过程中,会产生以甘油为主的大量副产物,随着我国生物柴油产业的发展,副产物问题将日趋严重.假单胞菌可利用多种碳源合成具有良好生物可降解性和生物相容性的聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanonate,PHA),PHA可替代...     

两种嗜盐古菌中circRNA的鉴定与特征分析

环形RNA(circRNA)是一类特殊的闭合环状RNA,主要由5’末端和3’末端通过反向剪接的方式共价结合形成.在多细胞动物中,circRNA具有一定的进化保守性和组织特异性.古菌作为生物三大领域之一,大多生活在高温、高盐、低氧等极端环境中.对古菌的研究是认知生命进化不可缺少的一环.目前对于古菌circRNA鉴定及特征并没有系统性的研究.选取了地中海富盐菌和西班牙盐盒菌两种嗜盐古菌为研究对象,利用RNA测序(RNA-seq)技术和生物信息学手段,鉴定出两种古菌中circRNA的存在,并深入分析了circRNA的特点;最后以分子生物学手段,对两种嗜盐古菌中部分circRNAs进行验证.在地中海富盐菌中,检测到67个circRNAs;在西班牙盐盒菌中,检测到133个circRNAs.在这两种嗜盐古菌中,circRNA主要源于16S rRNA、23S rRNA、16S rRNA-23S rRNA和蛋白编码基因序列.     

嗜盐嗜碱放线菌的研究进展与展望

嗜盐嗜碱极端微生物主要分布于地球上的盐碱土壤中,嗜盐嗜碱放线菌适应并长期生存这一特殊极端环境,已具备独特的遗传特性和新陈代谢途径,能够产生具有开发利用价值的多种次生代谢产物,是一类极具应用前景的微生物资源。文章主要综述了嗜盐嗜碱放线菌的资源、分类标准、分布、系统学及其发展趋势、开发利用前景。     

小链霉菌HCCB10043敲除硫酯酶基因的工程菌株构建及其代谢产物的研究

小链霉菌(Streptomyces parvus)HCCB10043的主要代谢产物为脂肽类化合物A21978C,其基因组序列中包括了非核糖体肽合成酶(NRPS non ribosomal peptide synthetase)、聚酮合酶(PKS polyketide synthases)以及NRPS-PKS混合的多酶体系基因簇,它们的共同特点是在代谢产物生物合成簇中连接有一个硫酯酶域,即TE(thioesterase)domain.硫酯酶可以使已经合成的化合物链的合成过程终止,并且具有水解释放成熟脂肽以及环化线性脂肽链的功能.通过对联二吡啶类代谢产物合成簇中TE基因的敲除构得工程菌株,工程菌发酵结果表明联二吡啶类代谢产物产量减少.     

一种基因工程菌代谢丙酮酸能力的检测方法

建立一种快捷的检测基因工程菌代谢丙酮酸能力的方法,对于开展与丙酮酸相关的代谢流研究至关重要.本研究基于丙酮酸与2,4-二硝基苯肼发生羰基化反应的原理,建立了优化的丙酮酸检测体系;研究了葡萄糖等18种代谢相关物质对所建检测体系的影响;成功地将之推广到对发酵产物体系的检测中;利用含有丙酮酸甲酸裂解酶基因的大肠杆菌BL21工程菌发酵以丙酮酸为唯一碳源的培养基,结果进一步验证了该检测方法切实可行.     

奇妙的古菌——奇古菌(Thaumarchaeota)的代谢和功能多样性

<正>基于对SSU r RNA的系统发育分析,Woese于1977年提出了著名的三域学说,将那些生活于极端环境(如高盐、高温、低p H和缺氧等)中的古菌(Archaea)作为一个生命域独立出来,与细菌域(Bacteria)和真核生物域(Eucaryota)并列为生物的三大域。随后,进一步将可培养的古菌分为广古菌门(Euryarchaeota)和泉古菌门(Crenarchaeota)。广古菌门包括分布广泛且生理特征多样的产甲烷菌、极端嗜盐菌、嗜热嗜酸菌和嗜热菌;泉古菌门代表位于系统发育树根部最原始的古     

庆大霉素生物合成基因genY的研究

以绛红色小单孢菌G1008基因组为模板,构建genY基因缺失的同源重组质粒pFY103,经接合转移导入绛红色小单孢菌G1008和GK1101(△genK),筛选获得genY基因缺失工程菌GY105(△genY)和工程菌GKY205(△genK+genY),发酵、提取并经质谱检测分析代谢产物.结果表明,工程菌GY105和GKY205主要积累西索米星、庆大霉素C1a和C2b.证明genY基因缺失阻断了庆大霉素X2到G418的转化,说明genY基因参与庆大霉素生物合成过程中绛红糖胺C-6’位甲基化.     

嗜盐菌的基本特性分析

嗜盐菌是一类能够在高盐极端环境下生存、生长的原核微生物.嗜盐菌具有特殊的生理机制和生理特性,作为一类极具应用前景的新型的微生物资源,近年来在嗜盐机理、相容性溶质、细菌视紫红质和嗜盐菌素等基础研究,以及环境生物治理、酶制剂、生物电子和医药工业等应用研究方面引起了广泛关注.     

嗜盐古菌ABDH12的部分生理生化特征及Br蛋白基因部分序列的研究

文章分析新疆艾比胡嗜盐古生菌物种与细菌视紫红质（bacteriorhodopsin,BR）蛋白基因资源,对分离纯化到的极端嗜盐古生菌菌株ABDH12,对其进行了生理生化特性研究,采用PCR方法扩增技术和编码螺旋c至螺旋G的BR蛋白基因片断,测定了BR蛋白基因核心序列。基于生理生化特性和BR蛋白基因序列的同源性比较,以及系统发育分析表明,BR蛋白中对于完成质子泵功能以及与视黄醛结合的关键性氨基酸残基均为保守序列,位于膜内侧的序列比位于膜外侧的序列更保守,并且ABDH12中的螺旋C至螺旋G的蛋白与其他菌株差异明显,是两种新的BR蛋白,序列号为：FJ796897。迄今为止,国内极少有关艾比湖嗜盐古菌的BR蛋白研究的报道,文章可为今后研究同类极端环境中新的物种资源提供素材和参考。     

调控细胞形态相关基因表达提高P.putida KT2440突变株KTU-U13 生产PHA的能力#br#

聚羟基脂肪酸酯(PHA)是多种细菌都能合成的一类多元聚酯,它具有类似于合成塑料的物化特性,同时又具备了合成塑料所不具备的生物可降解性、生物相容性、光学活性、气体相隔性等诸多特性,被认为是最有前途的生物塑料之一.P.putida KT2440 突变株KTU-U13 是本实验室之前构建的生理性能好、PHA 产量高的优良底盘细胞,而据文献报道,细胞体积越大越有利于积累更多的包涵体,通过扩展细胞大小,包括长度和宽度,减少PHA 颗粒的空间障碍,增加每个细胞的PHA 积累,可以提高产量. 本实验希望通过调控细胞形态相关基因mreB、ftsZ 及sulA 的表达进一步提高突变株KTU-U13 的PHA 产量,结果显示无论对mreB 和ftsZ 基因进行质粒过表达还是sRNA 抑制都没能提高PHA 产量,而质粒过表达sulA 基因使PHA 产率提高了10.21%. 该结果为在突变株KTU-U13的基础上进一步构建PHA 高产菌株提供了可参考的策略.     

卡那霉素B工程菌的构建及其发酵特性研究

研究高产卡那霉素B产业化工程菌的构建.以主产氨甲酰卡那霉素B工程菌——黑暗链霉菌S.tenebrarius312为出发菌株,进一步敲除氨甲酰磷酸转移酶基因tobZ,获得直接产卡那霉素B的工程菌ST314.对工程菌ST314的生物合成潜力进行研究,在200L发酵罐上进行放大实验,测定各参数,并绘制发酵代谢曲线.结果表明,该菌株遗传特性稳定,产抗能力得到有效恢复,提高幅度接近2倍;该工程菌产卡那霉素B的能力达到4500 U/mL.黑暗链霉菌ST314的研究可以向产业化生产转移.     

海神单胞菌属的基因组测序数据分析

海神单胞菌属(Neptunomonas)于1999年被首次鉴定,目前包含8个菌种,其中6个已经完成全基因组测序。本文总结了海神单胞菌属的菌种特征和基因组信息,并利用基因组测序数据对该菌属的碳源利用途径、聚羟基脂肪酸酯代谢途径和芳香族化合物降解途径进行了分析。研究发现,海神单胞菌属具有完整的糖酵解和乙酸利用途径,普遍含有Ⅰ型和Ⅲ型的聚羟基脂肪酸酯合成酶,存在芳香族化合物的降解途径。基因组测序数据分析结果可以为海神单胞菌属在聚羟基脂肪酸酯合成与环境治理保护等领域的应用提供理论依据。     

整肠生菌发酵中杆菌肽高产的代谢调控

从目前厂家利用整肠生菌发酵生产杆菌肽效价低的实际情况出发,为了提高产量和质量,从杆菌肽代谢途径--次级代谢和初级代谢关系、碳代谢和磷代谢调节几个方面对杆菌肽合成的影响,论述了在发酵生产过程中,如何进行控制碳源的种类和数量以及磷的用量问题,碳源以3%的柠檬酸为好,磷的用量以0.1～1.0 mmol/L为宜,以便更有利于杆菌肽形成,从而达到高产的目的.同时为这种新型抗生素,即杆菌肽高产提供了必要的理论根据.     

偏甘油酯脂肪酶PrLip的重组表达及酶学性质表征

偏甘油酯脂肪酶因其独特的底物偏好性具有广阔的应用前景。研究从食品安全菌娄地青霉的基因组中发现了一个假定的偏甘油酯脂肪酶prlip基因,通过全基因合成技术获得该酶基因序列,并构建了PrLip组成型表达的毕赤酵母基因工程菌。工程菌在30℃发酵培养60h,发酵活力达到22.26U/mL。利用阴离子交换层析法纯化,获得纯度大于90%的脂肪酶PrLip。酶学性质研究发现该酶的最适反应温度为45℃,最适反应pH值为7.0,40℃的半衰期为6h,水解及酯化反应证实PrLip是一种偏甘油酯脂肪酶。脂肪酶PrLip具有良好的温度耐受性及对大多数表面活性剂的耐受性,使其具有广阔的工业应用前景。     

genP基因在依纽小单孢菌中表达的分析

庆大霉素生物合成过程中的genP基因和西索米星生物合成过程中的sisI基因属同工异源酶基因,均能催化绛红糖胺3′,4′-双脱羟基反应。本研究借助组合生物合成,探索绛红小单孢菌中的genP基因能否在依纽小单孢菌中表达。首先构建genP基因替换sisI基因的同源重组质粒pKPI4,并经接合转移将其导入依纽小单孢菌TS388中,最后再通过影印筛选及PCR鉴定获得genP基因替换sisI基因的工程菌PTI886。将野生型菌株TS388、sisI基因缺失突变株TI1102(TS388△sisI)及工程菌PTI886在同等条件下进行发酵,提取其代谢产物并经薄层层析及质谱分析。结果表明,突变株TI1102不能合成西索米星,而工程菌PTI886仍能继续合成西索米星,且代谢产物组分与野生型菌株TS388相比无明显变化,说明genP基因能在依纽小单孢菌中表达。本研究揭示了同工异源酶基因异源表达的可行性,可为今后不同微生物异源基因组合的研究提供借鉴。     

嗜热厌氧杆菌乳酸脱氢酶敲除对乙醇发酵的影响

为提高乙醇产率,通过同源重组的方式敲除嗜热厌氧杆菌乳酸支路中的乳酸脱氢酶基因,得到了嗜热厌氧代谢工程菌Δldh突变株.应用葡萄糖、木糖、葡萄糖/木糖混合糖3种碳源,分别对Δldh突变株与野生菌进行分批补料发酵产乙醇的研究.结果表明,与野生菌相比,Δldh突变株不仅显著提高了乙醇产率,而且提高了糖的消耗速率;Δldh突变株与野生菌都能以葡萄糖和木糖为基质生长,而与木糖为单一碳源相比,在葡萄糖/木糖共发酵时,木糖消耗速率有所降低;在以葡萄糖为单一碳源时,Δldh突变株的乙醇质量浓度和产率达到最高,分别为25.93 g/L和0.39 g/(L.h).     

纳他霉素合成生物学技术取得重大突破,实现产业化

<正>纳他霉素是国际广泛批准使用的生物防腐剂,市场前景巨大,但其生产菌发酵单位低,限制了其大规模应用,浙江省微生物生化与代谢工程重点实验室利用合成生物学技术近日取得了重大突破。实验室以自行选育的具有自主知识产权的工业链霉菌恰塔努加L10为高产改造对象,针对其内纳他霉素生物合成途径,敲除了主要杂质色素和其他次级代谢产物合成基因,消除了杂质合成;通过高表达PPTase基因提前激活纳他霉素合成基因簇;利用基因表达浓度梯度调控技术,改造纳他霉素合成酶之     

改造细菌基因组的双重选择系统的构建

对细菌基因的敲除与回补可以用于基因功能的研究和基因组的改造。传统的Red同源重组敲除系统依赖于抗性标记基因的正向选择,无法实现基因回补菌株的选择。文章通过构建具有独特优势的双重选择系统,将2种选择标记基因tetA和sacB构建到一个自杀质粒中,该质粒含有tetA-sacB双基因盒,可以利用该双基因盒的双重选择作用实现细菌基因组中基因的敲除与回补。结果表明：在敲除大肠杆菌MG1655中的lacZ基因时,利用构建的双重选择系统中tetA的抗生素耐药性成功筛选到阳性克隆;利用双重选择系统的反向选择作用,在含有镰刀菌酸和蔗糖的培养基上进行筛选,实现了lacZ基因的回补。