海洋微生物的化学生态学效应及其机制

我们从海洋微生物中分离、筛选具有各种生态学效应的次生代谢产物,根据次生代谢产物的化学性状和生态学效应分门别类,从重要门类中挑选典型代表在分子生物学水平上进行系统地研究,揭示其作用机制。在原工作基础上,进一步完成了对8株抗海洋生物病原细菌和抗海洋污损生物幼虫附着的活性菌株中活性次生代谢产物的研究,共分离鉴定了100余个次生代谢产物,发现39个新化合物和20多个具有抗污损、抗菌、海虾幼虫致死活性的化合物;初步阐明了一个具有强抗藤壶幼虫附着的生物碱抗附着的作用机制;对16个活性菌株的发酵液粗提物和活性化合物进行了抗海洋污损生物附着的野外海上挂板实验,发现2个具有显著海上抗污损能力的活性物质。以S.oneidensis为模型菌株,深入研究微生物生态群落的形成机制及其调控。找到了细菌组装鞭毛丝的2个亚基的主要差异,并发现糖基化对鞭毛丝亚基的功能至关重要;明确了细菌对不同氧化还原环境的适应性来自呼吸调控系统的转换,并进一步研究了硝酸/亚硝酸呼吸途径的调控机制;深入研究了细菌响应青霉素类抗生素的分子机制,表明青霉素通过一条全新的信号通路调控β-内酰胺酶基因的表达。我们还对S.oneidensis MR-1是如何应答由H2O2引起的氧胁迫进行了研究,发现在这种细菌中,氧化应答机制和E.coli等一些研究过的菌株中有着明显的区别。     

海绵共附生放线菌HNS054菌株的鉴定及发酵液抑菌活性研究

海绵共生微生物是海洋活性化合物的重要来源之一,从广泛分布于福建沿海的山海绵(Mycale sp.)中分离可培养共附生微生物,并对其进行抑菌活性筛选,发现能产生抑菌活性物质的微生物,寻找具有潜在应用价值的化合物.从分离的64株细菌和21株放线菌海绵共附生微生物中,筛选到一株具有强烈拮抗革兰氏阳性菌的放线菌菌株HNS054,结合其培养特性、生理生化指标测定、孢子形态学观察及16SrRNA基因序列,看家基因atpD、recA、rpoB和trpB多基因联合分析,初步鉴定该菌为Streptomyces labedae.对该菌活性产物抑菌效价进行分析,结果表明:发酵液粗提物(1mg/mL)的抑菌能力略低于四环素(1mg/mL)和氨苄青霉素(1mg/mL),同万古霉素(1mg/mL)和环丙沙星(1mg/mL)相当,高于链霉素(1mg/mL).该活性物质对温度敏感,最高耐受温度为60℃;活性物质在碱性条件下稳定,酸性条件(pH≤3)下失活,分子排阻层析所得物质经全波段扫描,发现它在230nm有较高的吸收值.研究结果将为后续活性物质的进一步分离纯化奠定基础.     

柳珊瑚Anthogorgia caerulea相关可培养细菌抗污活性筛选

用4种不同培养基分离纯化柳珊瑚Anthogorgia caerulea中的相关可培养细菌。对获得的90株细菌,先用4株海洋污损指示菌进行活性初筛,获得11株具有抑制海洋污损指示菌生长的细菌后,再用2种抗海洋污损生物幼虫进行活性复筛,复筛得到5株对海洋污损生物幼虫附着有抑制活性的细菌。这5株细菌经16SrRNA基因序列分析,确定其系统发育地位为芽胞杆菌属（Bacillussp．）。     

广西北部湾局部海域海洋沉积物细菌多样性及生物活性评估

为有效探究海洋新型天然微生物资源,本研究以广西北部湾局部海域海洋沉积物样品为研究对象,采用高通量测序技术和纯培养分离方法分析海洋沉积物样品中细菌群落组成及多样性,利用双层琼脂扩散法检测纯培养菌株的抗菌活性,通过PCR扩增法筛选基因组中含有7种功能基因的阳性菌株。高通量测序结果显示：海洋沉积物中检测到1407个操作分类单元（Operational Taxonomic Units,OTUs）;在门水平上,变形菌门（Proteobacteria）的物种丰度最高,其次是厚壁菌门（Firmicutes）和酸杆菌门（Acidobacteria）。纯培养分离纯化鉴定出278株菌,分布在3门5纲16目24科31属,其中YIM 150853为1个潜在新分离单元。生物活性评估实验表明,76.34%的纯培养菌株至少对1种指示菌有抑制作用,其中链霉菌YIM 150601、YIM 150634抑菌谱广、抑菌活性强,放线菌的功能基因检出率高于非放线菌。广西北部湾局部海域海洋沉积物中蕴藏着丰富的细菌资源,纯培养菌株具有抗菌及合成生物活性产物的潜力,是开发新型天然产物的新菌源。     

海洋真菌Aspergillus sclerotiorum33-4中抗菌活性成分

研究海洋真菌Aspergillus sclerotiorum 33-4中的抗菌活性成分.利用硅胶、反相ODS、Sephadex LH-20、半制备HPLC等色谱学方法对菌株固体发酵物行分离纯化;利用NMR、MS、UV、IR等波谱学技术手段,结合文献数据比对,确定化合物的结构.并通过微量肉汤稀释法测定了单体化合物的多种抗菌活性.分离鉴定了4个化合物,分别为Penicillic acid(1)、Sclerotiotide A (2)、sclerotiotide B (3)、sclerotiotide F (4),其中化合物1具有较好的抗菌活性,化合物2-4具有中等抗菌活性.海洋真菌Aspergillus sclerotiorum 33-4能够产生一系列环肽类化合物,其中部分化合物具有良好抗菌活性.     

海洋真菌抗氧化活性物质的初步研究

采用化学发光法对81株分离自深海沉积物的真菌和93株红树林的内生真菌进行抗氧化活性物质的筛选.结果表明,供测菌株中有7株深海真菌、1株红树林内生真菌对于活性氧具有抑制作用,占供测菌株的4.60%.在7株深海真菌中有3株对羟基自由基和过氧化氢均表现出了较好的抑制作用.进一步采用化学发光法和DPPH法追踪上述3株深海真菌(114、115、134)发酵产物的水溶性聚糖和有机相中的抗氧化活性物质,发现有机相表现出较好的抗氧化活性,3株真菌的IC50分别是:1.92、55.55和11.23μg/mL(.OH);1.45、13.79和72.29μg/mL(H2O2);112.45、58.87和169.39μg/mL(DPPH);而水相中的水溶性聚糖也具有不同程度的抗氧化活性.海洋真菌是产生抗氧化活性物质的重要资源.     

一株真菌所产环缩酚酸肽类化合物的分离和鉴定

对一株真菌ZME及其所产的次级代谢产物进行分离鉴定。通过形态观察和ITS测序对真菌ZME进行菌株鉴定,并对其发酵液上清液和菌丝体分别用乙酸乙酯和甲醇萃取;萃取后的有机试剂粗提物经硅胶柱层析和半制备HPLC分离纯化;纯化后的各组分利用光谱分析进行结构解析。结果表明,真菌ZME初步判断属于Beauveria felina。对这株真菌次级代谢物结构解析,共鉴定5个化合物Isaridin B、Isaridin A、Roseocardin、Roseotoxin B和Destruxin B,这5个化合物均为环缩酚酸肽类化合物,其中Roseocardin具有抗细菌活性。     

海绵共附生真菌Penicillium sp.YZ-7的次级代谢产物

为寻找抗污损活性先导化合物,通过硅胶柱层析和Sephadex LH-20凝胶柱层析对海绵共附生真菌Penicillium sp.YZ-7次级代谢产物的化学成分进行分离,借助现代波谱学技术(NMR、MS、IR等)及文献数据确定分离得到的化合物,并以海洋污损细菌为抗污损活性筛选模型对化合物进行抗污损活性初步评价.从真菌Pe...     

深海沉积物中产淀粉酶细菌的rep-PCR基因指纹分析

利用淀粉酶筛选培养基平板从27个深海沉积物样品中筛选得到30个具有胞外淀粉酶活性的菌株.其中革兰氏阴性细菌有22株,阳性细菌有8株.对这些细菌的基因组DNA进行ERICPCR和BOXPCR扩增,指纹图谱显示大部分菌株均存在数目不等的各自独特的带型,各特异性扩增的主带型能重复稳定出现.比较两种引物的指纹图谱,显示ERICPCR比BOXPCR具有较丰富的图谱多态性.对产生的指纹图谱进行聚类学分析,30株细菌可分为10组,其中5株细菌分别独立成组,最多的第Ⅱ组包含有8株细菌,而在同一聚类组内的细菌可能是处于进化上亲缘关系较近的位置.研究显示,30株菌具有丰富的种属多样性,揭示了深海微生物资源的丰富和潜力.ERICPCR和BOXPCR技术可用于对深海微生物群落组成和多样性的研究.     

消癥益肝片中抗肝癌活性成分的分离纯化和结构鉴定

目的分离、纯化及鉴定消癥益肝片中抗肝癌的活性物质。方法采用Sephadex LH20和反相制备高效液相色谱柱分离纯化;采用MS、1H-NMR等波谱分析进行结构鉴定;利用MTT法检测化合物的抗肝癌活性。结果经分离纯化,获得3个活性小分子化合物,分别为苯甲酸(I)、对羟基苯甲酸乙酯(II)、对羟基苯甲酸丙酯(III)。MTT实验表明,三个化合物均有体外抑制Hep G2细胞增殖的活性,其中化合物II和III作用较强,并呈时间-剂量依赖关系。结论鉴定出3个小分子化合物,均为首次从消癥益肝片中分离得到,具有体外抑制肝癌细胞生长的活性。     

深海沉积物中产淀粉酶细菌的rep—PCR基因指纹分析

利用淀粉酶筛选培养基平板从27个深海沉积物样品中筛选得到30个具有胞外淀粉酶活性的菌株．其中革兰氏阴性细菌有22株．阳性细菌有8株．对这些细菌的基因组DNA进行ERIC—PCR和BOX—PCR扩增．指纹图谱显示大部分菌株均存在数目不等的各自独特的带型．各特异性扩增的主带型能重复稳定出现．比较两种引物的指纹图谱．显示ERIC—PCR比BOX—PCR具有较丰富的图谱多态性．对产生的指纹图谱进行聚类学分析．30株细菌可分为10组．其中5株细菌分别独立成组．最多的第Ⅱ组包含有8株细菌．而在同一聚类组内的细菌可能是处于进化上亲缘关系较近的位置．研究显示，30株菌具有丰富的种属多样性．揭示了深海微生物资源的丰富和潜力．ERIC—PCR和BOX—PCR技术可用于对深海微生物群落组成和多样性的研究．     

青海湖中低温菌的分离及生化测定

采用平板涂布法和划线分离法对青海湖水样进行了初步的分离纯化,筛选出可培养低温微生物14株,其中细菌9株,真菌3株,放线菌2株;经过初步的分类有8个耐冷菌和6个嗜冷菌;而且其中有不少产低温淀粉酶、脂酶、蛋白酶和氨基酸脱羧酶的有用微生物。     

延胡索内生真菌的分离鉴定及产功能酶菌株的初步筛选

采用纯培养分离方式获得纯化延胡索内生真菌菌株,通过形态学特征、ITS r DNA序列分析对分离菌株进行鉴定,利用6种培养基筛选出代谢产功能酶菌株。分离获得312株内生真菌,可归类于9个属,其中镰刀菌属是优势类群。对已测序的30株内生真菌产酶活性研究表明20株试验菌株产纤溶酶,18株产复合酶,16株产碱性蛋白酶,10株产接触酶,1株产纤维素酶;其中4株内生真菌可代谢产生4种不同功能酶,为代谢产多酶系菌株。延胡索内生真菌的分离鉴定及产功能酶菌株的筛选不仅丰富了内生真菌资源,而且也为获得新颖结构化合物提供理论基础。     

碱蓬内生真菌JP3的分离、鉴定及促生作用研究

为研究盐生碱蓬(Suaeda glauca)植物体内生菌及其产生的生物学活性物质对植物的促生长作用,利用组织分离法对碱蓬内生菌进行分离;用水培法测定碱蓬内生真菌对水稻幼苗株高、干重、叶绿素含量等生理指标的影响;对具有明显促生活性的菌株根据形态、培养特征和18SrDNA测序分析进行分类鉴定。从健康碱蓬植株的根、茎、叶中分别分离出19株、70株和49株,共138株内生菌,其中细菌13株、真菌122株、放线菌3株;筛选出对水稻幼苗具明显促生活性的真菌JP3,由该菌处理的水稻幼苗与对照相比其干重增加12.23%,株高增加15.6%(P0.05),总叶绿素含量增加了13.2%;18SrDNA测序和比对结果显示JP3属Glomerella cingulata,相似性大于97%。研究表明:碱蓬植物内生菌具有丰富、多样的特点,是产生促生物学活性物质的重要微生物资源,可为开发新的植物促生剂提供生物源物质。     

产体外抗鼻咽癌物质红树林土壤细菌筛选及其活性成分分析

研究一株通过活性筛选获得的、具有抗鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma, NPC)活性物质生产潜力的细菌,对其所产活性物质进行分离纯化,以探讨其抗肿瘤研发价值。以鼻咽癌肿瘤细胞株TW03和5-8F作为测试对象,利用细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK8)法从广西北海采集的红树林土壤中筛选出具有体外抗鼻咽癌活性物质生产潜力的细菌,通过基因分析、细菌形态以及生理生化特性对活性菌株进行分类鉴定,通过柱层析分离和活性测试追踪法从菌株的发酵液中获得具有体外抗鼻咽癌活性的化合物,并应用核磁共振波谱和低分辨质谱鉴定其结构。结果表明,经16S rRNA和看家基因(atpD和rpoB)的多位点序列分析鉴定菌株归属于链霉菌,命名为Streptomyces sp.MCCG 218。从该菌株的发酵液中分离得到一个活性化合物1,经图谱分析和文献比对确认该化合物为巴弗洛霉素A1衍生物(17,18-dehydro-24-demethyl-bafilomycin A1),其对鼻咽癌细胞株TW03和5-8F表现出较强的细胞增殖抑制活性,半抑制浓度(HalfInhibitor...     

蜡样芽孢杆菌BWL-001代谢产物及抗弧菌活性研究

本研究旨在从1株海南霸王岭热带雨林土壤来源的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus) BWL-001中挖掘抗海洋弧菌(Vibrio)的活性代谢产物,采用多种现代色谱分离方法对菌株提取物进行分离纯化,通过核磁共振波谱解析确定单体化合物结构,并结合96孔板微量稀释法进行抗弧菌活性测试。结果显示,从该菌株LB培养基发酵产物中分离鉴定出10个单体化合物,包括4个二酮哌嗪类化合物(1-4)、3个吲哚生物碱衍生物(6-8)以及3个其他类化合物(5、9和10),分别命名为3-异丁基吡咯并哌嗪-2,5-二酮(1)、cyclo-(Pro-lle)(2)、maculosin (3)、trans-cyclo-(Pro-Phe)(4)、anthranilic acid (5)、indole-3-meth-ylethanoate (6)、indole-3-acetic acid (7),nb-acetyltryptamine (8)、thymine (9)、acetamide (10)。其中,化合物6-8对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)有弱的抑制活性,其最小抑菌浓度(Mini...     

舟山海域海泥细菌的分离及抗水产病原弧菌的筛选

采集中国东海舟山海域海底不同层次9个海泥样品,通过稀释培养分离纯化得到海洋细菌78株。采用滤纸片琼脂扩散法测定上述分离所得海洋细菌对鳗弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、费氏弧菌等5种水产病害常见病原弧菌的抑制作用,获得具有抑弧菌作用的海洋细菌17株,占21.8%。其中6株菌株对费氏弧菌有明显的抑菌作用,占7.7%。7株菌株对哈维氏弧菌的抑菌作用较显著,占9.0%。2株菌株对创伤弧菌有明显的抑菌作用,占2.6%。2株菌株对溶藻弧菌和鳗弧菌显示一定的抑制作用,各占1.3%。研究结果表明:通过稀释培养法能分离到一定数量和种类的海洋细菌;来自海底泥的海洋细菌中存在较多的具有水产病原弧菌拮抗活性的菌株。     

博落回内生真菌的分离及其抗菌活性的初步研究

从健康博落回植株中分离内生真菌,用PDA培养基分离纯化菌株,结果纯化得到19株内生真菌,用琼脂块法对获取的菌株进行抗菌活性筛选,其中有2株博落回内生真菌对指示菌株有抑菌作用,占总分离菌株的10.53%,其中有一株内生真菌具有较强的抑菌活性。     

海洋微生物次生代谢的生物合成机制

海洋微生物,日益成为新颖次级代谢产物发现的理想资源。该课题在前期研究基础的基础上,继续进行抗菌、抗肿瘤和抗污损等结构新颖、活性独特的次级代谢产物的挖掘,同时开展这些化合物的生物合成机制研究,揭示酶学机理,提出次级代谢产物生物合成途径的分子和化学模型,进而利用组合生物学技术扩展其结构多样性,为获得具有自主知识产权的创新药物提供物质基础。     

陕西略阳铁矿尾矿放线菌的分离、鉴定及抗菌活性

针对陕西略阳铁矿尾矿土壤放线菌进行分离鉴定,研究放线菌代谢产物抗菌活性。采用稀释涂布法对陕西略阳铁矿尾矿土壤样品进行分离纯化,通过菌落形态观察初步排重,对所有菌株进行16S r RNA测序,通过构建发育树确定其菌属。同时采用滤纸片扩散法,以大肠杆菌(Escherichia coil)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、沙门氏菌(Salmonella typhl)和白假丝酵母菌(Canidia Albicans)为靶标菌研究放线菌代谢产物拟菌活性。分离出菌株结合形态学及分子生物学鉴定确认14株菌株,其中10株属链霉菌属(Streptomyces)、3株属于小单孢子菌属(Micromonospora)、1株属原小单孢菌属(Promicromonospora)。鉴定所得14株放线菌代谢产物均表现出不同程度的抑菌活性,其中10株则表现出较明显的抑菌作用,占总数的71.43%。表明尾矿土壤所分得菌株丰富,可判断所分离放线菌中链霉菌属占较大比例,且筛选出有较强抑菌活性的菌株,为丰富和挖掘放线菌资源库提供理论依据。