绵羊体细胞克隆胚胎的异常DNA甲基化模式

以体外受精胚胎作为对照, 利用抗5-甲基胞嘧啶抗体免疫荧光法对绵羊体细胞克隆胚胎的基因组甲基化模式进行了分析. 实验结果表明: (ⅰ) 在着床前发育过程中, 体细胞克隆胚胎呈现出与体外受精胚胎类似的去甲基化趋势, 即在8-细胞期甲基化水平降到最低点, 紧接着在桑椹胚时又升高, 但是克隆胚胎的甲基化水平明显高于同一时期的体外受精胚胎, 特别在8-细胞期及其以后时期; (ⅱ) 克隆囊胚的甲基化模式与体外受精囊胚不同, 克隆囊胚的内细胞团(inner cell mass, ICM)和滋养层(trophectoderm cells, TE)甲基化水平相当, 而体外受精囊胚的内细胞甲基化水平低于滋养层. 研究结果表明, 与体外受精胚胎相比, 克隆胚胎的DNA甲基化重编程存在异常, 它可能是导致克隆胚胎发育失败的原因之一.     

两性小鼠核移植胚胎干细胞系的建立及其在胚胎干细胞多能性评估中的研究

治疗性克隆的安全性与风险性是阻碍治疗性克隆发展的关键环节之一. 由于受到社会伦理问题的限制, 人胚胎干细胞的多能性检测只能通过畸胎瘤的方式鉴定, 与传统的小鼠生殖系嵌合鉴定方式不同. 但是两种多能性检测方式之间的区别还不清楚. 本研究利用遗传突变两性小鼠心肌成纤维细胞作为核移植供体细胞, 构建核移植胚胎, 经过体外培养获得克隆囊胚, 建立核移植胚胎干细胞系. 对胚胎干细胞系的鉴定结果表明, 两性小鼠核移植胚胎干细胞系表达所有小鼠胚胎干细胞系多能性及特异的分子标记, 如碱性磷酸酶活性, Oct4, Nanog, SSEA-1等, 干细胞注射到免疫缺陷小鼠(SCID)体内能够形成含有三胚层分化附属物的畸胎瘤组织, 证明两性小鼠核移植胚胎干细胞系具有多能性. 但通过囊胚注射的方式获得的二倍体嵌合小鼠经过交配不能获得生殖系嵌合的小鼠, 因而两性小鼠核移植胚胎干细胞系并不具有全能性, 说明体内形成三胚层分化附属物的畸胎瘤组织并不能替代传统的生殖系嵌合, 提示在人治疗性克隆胚胎干细胞系多能性鉴定中, 仍然需要更多、更严格的标准, 进而最大程度地降低治疗性克隆临床应用的风险性.     

标记基因是克隆的死因

“多利”羊昨天庆祝了它的 5岁生日。然而 ,大多数克隆动物却没有这样幸运 ,它们很少长到成年 ,甚至出生前就死去了。美国研究人员现在已经知道克隆动物成功率如此之低的原因。克隆的不可预测性似乎是由于某些不稳定的基因。这些基因的激活依赖于它们胚胎时生存于哪个母体中。这些“标记”基因哪些被激活 ,哪些被关闭 ,在克隆胚胎和正常胚胎之间存在着极大的差异。麻省理工学院的鲁道夫·詹尼斯 (ＲｕｄｏｌｆＪａｅｎｉｓｃｈ)及其同事们用胚胎干细胞核克隆了老鼠。这项研究显示胚胎干细胞比成年细胞的克隆成功率更高。苏格兰罗斯林研究所 …     

核移植方法和活化方法对小鼠体细胞克隆胚胎发育的影响

用卵丘细胞为核供体进行小鼠体细胞克隆, 成功获得了一批成年体细胞克隆小鼠. 为探讨不同核移植方法和重构胚活化方法对小鼠克隆胚发育的影响, 用B6D2F1小鼠的卵丘细胞和卵母细胞作为供、受体进行核移植实验, 采用电融合和细胞质内直接显微注射的方法进行核移植, 并采用电脉冲、乙醇处理、氯化锶处理和电脉冲联合氯化锶4种不同方法对重构胚进行活化, 对克隆胚胎的体外及体内发育进行研究. 结果显示, 利用显微注射法获得重构胚胎的工作效率(90.7%)显著高于融合法获得重构胚胎的工作效率(49.7%). 乙醇、电脉冲和氯化锶3种激活方法都可以诱导孤雌胚发育到囊胚, 但前二者处理的胚胎的囊胚发育率(52.4%, 54.2%)显著低于后者(76.9%). 10 mmol/L氯化锶处理6 h活化效果最好. 融合法获得的重构胚经氯化锶或者电脉冲联合氯化锶激活后, 囊胚发育率(9.5%, 8.6%)显著高于单纯电脉冲激活(2.6%), 而乙醇活化的重构胚没有发育到囊胚阶段. 用显微注射法经氯化锶激活获得的重构胚的囊胚发育率最高(16.6%). 注射法和融合法获得的重构胚胎经氯化锶激活后进行胚胎移植, 都获得了发育到期的体细胞克隆小鼠, 发育到期率分别为 2.5%和1.4%. 结果表明, 两种核移植方法对B6D2F1 小鼠重构胚胎的早期发育能力有一定影响, 用这两种方法都可以获得体细胞克隆小鼠; 不同活化方法对重构胚胎的体外发育能力有显著影响, 在上述4种激活方式中, 氯化锶处理对克隆胚的激活效果最好.     

低氧培养早期胚胎克隆小型猪(Sus Scrofa)

猪的体细胞克隆在人类的异种器官移植方面有着巨大的应用前景. 以中国实验用小型猪胎儿成纤维细胞为核供体, 从屠宰场采集初情期前母猪的卵巢, 卵母细胞体外成熟后去核构建克隆胚胎, 重构卵电融合并激活, 在7% O₂, 5% CO₂及88% N₂的气相条件下NCSU-23或PZM-3培养基培养. 给3头代孕母猪移植230枚克隆胚胎, 其中一头妊娠足月并产下3头仔猪, 生产克隆猪的效率达到1.3%; 其中一头健康状况良好, 存活至今, 毛色及DNA微卫星遗传分析证实为克隆个体. 以上结果表明, 利用初情期前母猪的卵母细胞, 克隆胚胎培养在低氧条件下, 是生产克隆猪的一条有效途径.     

克隆人类胚胎:制造天使还是放出魔鬼?

人类胚胎首次克隆潘多拉盒终于打开2 0 0 1年 11月 2 5日 ,位于马萨诸塞州的美国先进细胞技术公司 (ＡＣＴ)宣布已成功克隆出人类胚胎。就像当年第一只克隆羊诞生所带来的巨大冲击一样 ,人类克隆胚胎的出现 ,国际医学界为之震动 ,围绕该研究的伦理道德问题再次摆在世人面前。美国先进细胞技术公司的首席执行官米歇尔·韦斯特 (ＭｉｃｈａｅｌＷｅｓｔ,见图 )在宣布这一成果时说 :“这次实验采用了 8个卵细胞样本 ,其中的两个形成了 4个细胞的胚胎 ,在分裂到 6个细胞时停止了分裂。”韦斯特还说 ,首次克隆出的人类胚胎“很初级” ,数目还不足…     

人类胚胎研究进入全控时代

去年8月21日,英国政府终于批准科学家使用人类胚胎进行研究,但同时又指出,以复制为目的的人类胚胎克隆仍属违法.英国卫生部长宣布,允许研究人员从最多已经发育了14天的胚胎中提取细胞,然后利用这些细胞培育出皮肤和其他组织.消息公布后,英国各界反应不一.英国科学界对此表示欢迎,但一些宗教组织和反堕胎团体则指责政府的做法无异于支持谋杀.     

中国红系冀南黄牛的克隆及其繁殖性能

以濒临灭绝的中国红系冀南黄牛的颗粒细胞为核供体进行了体细胞克隆研究. 共操作卵母细胞211枚, 去核166枚(79%), 构建重构胚112枚(67.4%), 其中分裂的重构胚为94枚(83%), 第7天发育成囊胚数为48枚(43%). 共移植荷斯坦奶牛受体6头, 妊娠2头(33%), 其中1头流产, 另1头产出一头健康牛犊. 比较了不同融合液(甘露醇和Zimmerman融合液)对克隆胚胎融合率和囊胚发育率的影响以及不同激活方法(钙离子载体(A23187)+6-DMAP和放线菌酮+CB)对克隆胚胎囊胚发育率的影响. 结果表明: (ⅰ) 在电场强度为2.5 kV/cm, 脉冲时间为10 ms, 脉冲次数为2的条件下, 克隆胚胎在甘露醇融合液中的电融合率比在Zimmerman融合液中的电融合率高(71% vs 61%, P＜0.05), 且囊胚发育率差异不显著(36% vs 39%, P＞0.05 ); (ⅱ) 以钙离子载体(A23187)+6-DMAP激活组与放线菌酮+CB激活组处理的克隆胚胎囊胚发育率无明显差别(42% vs 46%, P＞0.05). 依据牛的28个微卫星位点对供体牛、克隆牛和代孕母牛进行微卫星分析, 结果表明, 克隆牛与供体牛的遗传物质完全相同, 而与代孕母牛在遗传上无任何相关. 目前, 该克隆冀南黄牛已经产犊, 克隆冀南黄牛的各项繁殖性能指标均与正常冀南牛犊相符, 所产牛犊的生长发育正常.     

韩、美科学家用病人体细胞培育出干细胞系

韩国和美国科学家5月19日宣布，他们运用体细胞核转移技术，用病人身上的皮肤细胞克隆出早期胚胎，然后提取新的胚胎干细胞系。这使干细胞研究向实用的“治疗性克隆”前进了一大步。     

第一个人类克隆胚胎的故事

通过一种称为单性生殖 (孤雌生殖 )的机制 ,我们从卵细胞中克隆得到了早期的人类胚胎 ,这使治疗性克隆成为了触手可得的事情——     

体细胞克隆中核的重编程

尽管体细胞克隆在绵羊、牛、小鼠、猪、山羊、兔、猫、大鼠和骡子等物种中都获得了成功, 但却未能得到狗和猕猴的克隆个体, 而且克隆效率非常低. 克隆效率低使体细胞克隆技术在科研和生物技术等方面的应用受到限制. 供体核移入去核的卵细胞后, 必须经过表观遗传修饰的重编程, 回到胚胎开始发育的全能状态. 目前认为: 供体核的不完全重编程是导致克隆效率低的主要原因. 本文从DNA甲基化、组蛋白乙酰化、X染色体失活、端粒、印记基因以及其他发育相关基因的表达几个方面来探讨影响克隆效率的因素.     

用ENU诱导斑马鱼突变的初步研究

斑马鱼作为一种脊椎动物发育模型, 正越来越受到重视. 用ENU诱变的方法, 建立了320个斑马鱼F2家系. 通过对F3代胚胎的表型观察, 鉴定在外包、体轴、体节、头部、心血管系统等表现异常的突变体. 目前已获得35个突变品系, 其中以体轴和体节异常的突变体为主. 这些突变体斑马鱼品系的建立为克隆突变的基因、研究胚胎早期发育机制打下了良好的基础.     

山羊(Capra hircus)胚胎细胞经继代细胞核移植后其发育能力的研究

细胞核移植是研究细胞核和细胞质相互关系问题的最理想的方法之一.继代细胞核移植或称再克隆(recloning)可以了解同一胚胎分裂球或细胞经继代细胞核移植之后,它们全能性的功能是否有变化,如有变化,在第几代开始有变化,如没变化则能稳定几代.如果继代细胞核移植可行的话,将会成为获得大量基因型等同的无性繁殖系动物的理想方法.本文主要研究山羊胚胎的分裂球或细胞经继代核移植后仍具有全能性发育的可能性.本实验结果首先在国内外获得了一批继代核移植后的小羊羔.为我国优质家畜克隆动物的繁育奠定了理论和技术的基础.     

体细胞克隆法生产绵羊转基因囊胚

pEGFP－N1质粒分别转染5只绵羊卵巢原代颗粒细胞,G418筛选后,各取1株阳性转基因细胞作供体,进行绵羊的体细胞核移植（克隆）,共352枚体外成熟的去核卵母细胞与转基因的颗粒细胞进行电融合,得到的329枚核移植胚胎（93．5％）,用Ionomycin／6－DMAP激活,SOFaaBSA液滴体外培养7d,结果显示,312枚核移植胚胎发生卵裂（94．8％）,其中63枚发育至囊胚阶段（19．1％）,随机抽检发现,克隆胚胎在早期发育的各个阶段均表达GFP基因,4株0．5％FCS饥饿细胞克隆胚胎的囊胚率为19．6％（55／280）,胎在早期发育的各个阶段均表达GFP基因,4株0．5％FCS饥饿细胞克隆胚胎的囊胚率为19．6％（55／280）,与另外1株未饥饿细胞克隆胚胎的囊胚率（16．3％,8／49）没有显著差异（P＞0．05）,结果表明,体细胞基因转移和克隆技术的结合,可以有效地生产绵羊的转基因囊胚。     

克隆猴、基因鸡尾酒和黄禹锡事件——干细胞研究进展及科学话语权之争

2007年11月14日,英国著名的科学刊物<自然>周刊在其网站上发表了一篇来自美国的科学论文,不声不响地爆出了一条为全球瞩目的科学消息:美国科学家率先克隆出了人类的灵长动物表兄弟猴子的早期胚胎.     

克隆的骡子

当全世界在关注着是否能进行人类胚胎的克隆时,克隆的骡子已经悄然来到了我们身边世界科学2006.8也许你已经知道了有关骡子克隆的情况,它不再是什么秘密了,也不是需要全体国民深思的话题。或许,它应该成为全体国民关注的话题。日前有这样一则报道:全世界第一头克隆骡子“爱达荷     

克隆大事记

1995年7月,苏格兰科学家运用早期胚胎细胞成功地克隆出了两头绵羊,这被看作是多莉诞生的前奏。 1997年2月,苏格兰科学家用从一只6岁母羊的乳房上取下的组织克隆了绵羊“多莉”。     

以胚胎干细胞为核供体能促进异种重构胚的体外发育

体细胞在异种成熟的去核卵母细胞中能够去分化和重编程,并能发育到囊胚,甚至能全程发育正常出生。为了评价胚胎干细胞作为供核细胞在异种动物克隆中的意义,以小鼠胚胎干细胞（ES）为核供体,兔成熟的去核卵母细胞为受体构建异种重构胚,分析其在体外的发育能力,并以小鼠胚胎成纤维细胞和成年小鼠外耳皮肤的成纤维细胞为对照。通过核移植的方法分别把3种细胞移入成熟的兔去核卵母细胞透明带下,经电融合和激活后,在体外培养,胚胎干细胞作为供核细胞所构建的异种重构胚在体外发育到囊胚的比例为16.1％,明显高于用成年小鼠外耳皮肤成纤维细胞（0％～3.1％,P<0.05）和小鼠胚胎成纤维细胞（2.1％～3.7％,P<0.05）所构建的异种重构胚的体外囊胚发育率.重构囊胚细胞经染色体分析,证实其染色体来源于小鼠胚胎干细胞。以上结果显示,用胚胎干细胞作为供核细胞,比体细胞作为供核细胞所构建的异种重构胚更容易进行重编程,并且胚胎干细胞指导异种克隆胚胎正常发育的能力强于体细胞。     

我们应该为此担心吗?

在克隆羊多利诞生之后,迄今为止没有任何一个由人类体细胞克隆的婴儿出生,目前科学家仅仅想要培育克隆胚胎都够呛,更别说克隆人了. 相比之下,利用CRISPR基因编辑技术就相对比较容易了.有人担心,不至于简单到如同任何一个人在厨房就能做到的事,但只要有足够多的经费,一个由生物学家和试管授精医生组成的小团队可能会创造出第一个通过基因编辑而成的婴儿.这就是最令人害怕的事.     

克隆人与你共舞

２０００年底，位于美国内华达州沙漠地区的一家 从事动物克隆试验的神秘生物试验室突然向外界宣 布，该实验室将在２００１年１月正式开始克隆人类试 验，并希望能在２月份完成首例克隆人类胚胎的试 验。新世纪开始没多久，意大利著名的人工生育权 威塞韦里诺·安蒂诺教授更是抛出了一条令全世界 震惊的消息他计划克隆出世界第一个克隆人，以 使那些丈夫不育，而妻子又不愿意接受陌生男人精 子进行人工受孕的夫妇有机会养育真正属于自己的 孩子。紧接着，英国政府也解除了克隆人类最初级 胚胎的禁令。 不管支持也好，反对也罢，克隆人在这…